HO-1修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞對受損腸道保護作用及其機制的研究.pdf

1、目的：⑴探討骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)對體內(nèi)外活化T細胞的免疫調(diào)節(jié)作用。⑵探討血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)修飾的BM MSCs(HO-1/MSCs)及BM MSCs在單層腸上皮細胞環(huán)境中產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)及其機制。⑶探討HO-1/MSCs及BM MSCs在腸缺血再灌注損傷中的保護作用及其機制。
　　 方法：①取4～5周齡健康、

2、雄性Wistar大鼠，采用密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選法分離培養(yǎng)BM MSCs，流式細胞術(shù)鑒定第3代細胞的表型。②建立體外共培養(yǎng)模型:采用混合淋巴細胞共培養(yǎng)，在6孔板加入CaCo-2細胞建立單層腸上皮環(huán)境模型，將BM MSCs及HO-1/MSCs消化計數(shù)，每孔加入2×105個/mL，大鼠新鮮懸浮脾淋巴細胞計數(shù)每孔加入1×106個/mL，在除外空白組的各組加入10μg/mL的刀豆蛋白A(ConA)以刺激T淋巴細胞增殖。實驗分3個時間點:分別為

3、0、24、48 h，每個時間點7組，實驗組（脾淋巴細胞、HO-1/MSCs、CaCo-2、ConA）、對照組A(脾淋巴細胞、BM MSCs、CaCo-2、ConA)，對照組B(脾淋巴細胞、CaCo-2、ConA)，對照組C(脾淋巴細胞、HO-1、MSCs、ConA)，對照組D(脾淋巴細胞、BM MSCs、ConA)，增殖組（脾淋巴細胞、ConA），空白組（脾淋巴細胞）。MTT檢測T淋巴細胞活性，ELISA檢測細胞因子TNF-α、IL-1

4、0及TGF-β1水平，流式檢測Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞表達率。③模擬小腸移植腸缺血時間建立大鼠體內(nèi)腸道缺血再灌注損傷環(huán)境模型:取6～8周齡健康、雄性Wistar大鼠，術(shù)前均禁食12h，于無菌環(huán)境下分離大鼠的腸系膜上動脈，夾閉40min后松開血管夾，注射單細胞懸液或者相同劑量的生理鹽水，關(guān)腹，建立腸缺血再灌注損傷模型。④將模型組分4組:實驗組(1ml HO-1/MSCs細胞經(jīng)腸黏膜下植入)和BM MSCs對照組(1ml BM MSCs細胞

5、經(jīng)腸黏膜下植入），生理鹽水對照組(1ml生理鹽水經(jīng)腸黏膜下植入)，假處理組（開腹后不做任何處理，40min后關(guān)腹），各組分別于術(shù)后24h處死大鼠，留取動物血清和小腸組織標本備用;⑤采用酶聯(lián)免疫法檢測TNF-α的水平及免疫調(diào)節(jié)因子IL-10及TGF-β1水平;光鏡下觀察小腸組織的病理變化。
　　 結(jié)果：⑴體外成功分離培養(yǎng)出BM MSCs，經(jīng)流式鑒定第3代貼壁細胞陽性表達CD29、CD90及RT1A均達90％以上，載有HO-1的腺病

6、毒轉(zhuǎn)染第3代BM MSCs成功率達80％以上。⑵成功建立大鼠體外腸道環(huán)境共培養(yǎng)模型：MTT檢測脾臟T淋巴細胞0h，24h、48h活性，經(jīng)LOG10轉(zhuǎn)換后，實驗組24h、48h分別為-0.447±0.067、-0.455±0.027，BM MSCs對照組為-0.321±0.028、-0.323±0.026，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；ELISA檢測TNF-α、IL-10、TGF-β1水平，TNF-α、IL-10、TGF-β1

7、水平0h實驗組與對照組無差別，分別為69.865±18.953、275.92±9.714、275.92±9.714，BM MSCs對照組24h、48h TNF-α水平為95.737±5.981、96.471±7.863，實驗組為57.444±18.41、63±8.718;BM MSCs對照組IL-10水平24h、48h為404.949±10.181、366.016±5.18，實驗組為586.154±15.783、638.718±41.1

8、54;BM MSCs對照組TGF-β1水平24h、48h為441.27±12.716、433.231±29.224，實驗組為522.285±25.686、501.123±11.609;差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；流式細胞儀檢測T調(diào)節(jié)細胞表達率，其中24h、48h實驗組FoxP3+T調(diào)節(jié)細胞表達率均高于對照組，分別為實驗組8.1％、8.6％，BM MSCs對照組0.2％、0.1％。⑶模擬小腸移植腸缺血時間點，成功建立大鼠體內(nèi)腸缺血

9、再灌注損傷模型：ELISA檢測TNF-α、IL-10、TGF-β1水平，其中BM MSCs對照組、實驗組TNF-α水平24h分別為51.877±2.2、31.827±4.681，TGF-β1水平24h分別為748.79±87.943、1097.566±198.582，IL-10水平24h分別為995.956±57.057、1357.963±115.003。差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；形態(tài)學方面:BM MSCs對照組24h小腸組織

10、HE染色顯示:小腸絨毛水腫、腸上皮細胞壞死、腸道間質(zhì)充血及炎癥細胞浸潤程度與同時間點實驗組相比明顯較重。
　　 結(jié)論：⑴密度梯度離心聯(lián)合貼壁法方法簡單、可以大量體外擴增BM MSCs，純度較高。⑵在體外共培養(yǎng)腸上皮環(huán)境下，BM MSCs可以通過抑制炎性因子TNF-α的表達及促進免疫調(diào)節(jié)因子TGF-β1、IL-10及T調(diào)節(jié)細胞的表達發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，這一免疫調(diào)節(jié)作用的發(fā)揮可以被成功載入的HO-1所放大。⑶在腸缺血再灌注損傷模型中，