慢病毒介導HO-1基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細胞體外缺血損傷保護作用的實驗研究.pdf

1、目的：通過慢病毒介導HO-1基因轉(zhuǎn)染豬骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)，并建立體外模擬缺血性損傷模型，探討HO-1基因修飾對MSCs缺血性損傷的保護作用及其機制。從而為下一步HO-1基因修飾的MSCs移植治療心肌缺血的研究提供實驗依據(jù)。
　　 方法：采用密度梯度離心結合貼壁法分離、培養(yǎng)豬MSCs，并用免疫熒光法鑒定；用慢病毒包裝系統(tǒng)介導的HO-1基因轉(zhuǎn)染豬MSCs，通過熒光顯微鏡觀察并繪制轉(zhuǎn)染HO-1基因的MSCs(HO-1-MSC

2、s組)、未轉(zhuǎn)染HO-1基因的MSCs(MSCs組)生長曲線，觀察慢病毒轉(zhuǎn)染對MSCs增殖的影響。PCR檢測HO-1-MSCs組、MSCs組的HO-1mRNA表達；采用血清剝奪和缺氧(SOD)處理建立MSCs體外模擬缺血性損傷模型，通過流式細胞術檢測評價HO-1-MSCs組、MSCs組在SOD后3h、6h及9h時的凋亡、死亡情況，并通過RT-PCR、Western blot技術檢測兩組在SOD各個時間點的HO-1mRNA及HO-1蛋白的表

3、達情況。
　　 結果：密度梯度離心結合貼壁法能有效分離、純化豬MSCs，轉(zhuǎn)染48小時后，可檢測到強熒光出現(xiàn)，免疫熒光染色顯示培養(yǎng)的細胞CD44、CD105表達陽性；細胞計數(shù)并繪制生長曲線結果顯示，轉(zhuǎn)基因的MSCs與未轉(zhuǎn)基因的MSCs生長曲線沒有顯著差別，無統(tǒng)計學意義；HO-1-MSCs組較MSCs組在常氧培養(yǎng)條件下凋亡率(AR)(P>0.05)和死亡率(DR)沒有顯著差別(P>0.05)，無統(tǒng)計學意義；兩組MSCs在各SOD時間

4、點的AR和DR較常氧培養(yǎng)條件下均顯著性增高(P<0.01)，有統(tǒng)計學意義。在同一SOD時間點，HO-1-MSCs組較MSCs組的AR顯著性降低(P<0.01)，有統(tǒng)計學意義。RT-PCR、Western blot結果顯示：在常氧培養(yǎng)條件下，HO-1-MSCs組較MSCs組的HO-1mRNA和HO-1蛋白表達均顯著增高(P<0.01)，有統(tǒng)計學意義；在各SOD時間點，兩組MSCs的HO-1mRNA和HO-1蛋白表達較常氧均顯著性增高(P<

5、0.01)，有統(tǒng)計學意義；隨著SOD時間延長，兩組MSCs的HO-1mRNA和蛋白表達均逐步增強；在同一SOD時間點，HO-1-MSCs組較MSCs組的HO-1mRNA和HO-1蛋白表達均顯著性增加(P<0.01)，有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：
　　 1.根據(jù)黏附特性可成功分離、培養(yǎng)獲得豬骨髓MSCs。
　　 2.按MOI=20，慢病毒包裝系統(tǒng)可成功將HO-1基因轉(zhuǎn)染MSCs：效率肯定、相對安全，且對MSCs的增