慢病毒介導(dǎo)TGF-β1和IL-10基因轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的
　　 軟骨損傷性疾病是一類常見的、嚴(yán)重的疾病，發(fā)展到一定程度后可致殘，加重社會與家庭的負(fù)擔(dān)。關(guān)節(jié)軟骨損傷后自我修復(fù)能力很弱，目前軟骨缺損的修復(fù)仍無理想的方法，以致關(guān)節(jié)軟骨損傷成為了臨床上亟待解決的難題。近年來基因工程及組織工程技術(shù)的發(fā)展為解決這一難題提供了機(jī)遇。本課題采用基因轉(zhuǎn)染及組織工程技術(shù)，分別構(gòu)建表達(dá)TGF-β1及IL-10目的基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染體外分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，在細(xì)胞因子影響下誘導(dǎo)骨

2、髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向分化，通過各項(xiàng)指標(biāo)的檢測，更好的為多基因誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化提供理論依據(jù)，為構(gòu)建新型組織工程軟骨提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 材料和方法
　　 1取2-3月齡健康新西蘭大白兔，無菌條件下穿刺針抽取雙側(cè)脛骨平臺內(nèi)下側(cè)骨髓6-8ml，梯度密度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法提取BMSCs，進(jìn)行原代、傳代細(xì)胞培養(yǎng)。按加入慢病毒載體的不同分為三組:A組:TGF-β1;B組:TGF-β1+IL-10;C組:空載體組;C組:空

3、白對照組。
　　 2以TGF-β1和IL-10為目的基因，構(gòu)建TGF-β1-GFP及IL-10-RFP慢病毒表達(dá)載體。在重組基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染體系中，確定最佳轉(zhuǎn)染效率所需MOI值（感染復(fù)數(shù)）及作用時(shí)間。單基因(TGF-β1)及雙基因共轉(zhuǎn)染（TGF-β1和IL-10）在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 3取已轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，根據(jù)加入慢病毒載體及加入細(xì)胞因子IL-1β的不同分為六組:A組:TGF-β1;B組:TG

4、F-β1+IL-1β（IL-1β10ng/ml）;C組:TGF-β1+IL-10;D組:TGF-β1+IL-10+IL-1β;E組:空載體組，加誘導(dǎo)液;F組:空白對照組，常規(guī)完全培養(yǎng)基，不加任何誘導(dǎo)液。A-E組滴加軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液（組成:TGF-β310ng/ml、Vitc50μg/ml、地塞米松10-7M/L、含10％胎牛血清的α-MEM液。）培養(yǎng)。每日倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況，誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14天后，收集六組中的細(xì)胞，提取mRNA

5、，熒光定量PCR檢測SOX-9、Aggrecan、TypeⅡcollagen的表達(dá)，同時(shí)提取蛋白，WesternBlotting測定TypeⅡcollagen的表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)的BMSCs24h可見少量紡錘或短梭形細(xì)胞貼壁”48h后大多數(shù)細(xì)胞已貼壁、分裂，并出現(xiàn)由單個(gè)細(xì)胞分裂形成的細(xì)胞集落。5-7d后，細(xì)胞分裂增殖，形成多個(gè)細(xì)胞集落。傳代細(xì)胞貼壁快，5日左右即可長滿

6、瓶底形成單層，細(xì)胞核大，胞漿內(nèi)顆粒多，呈平行或漩渦狀生長。
　　 2含有單、雙目的基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs，轉(zhuǎn)染后12h即可有熒光表達(dá)，MOI值（感染復(fù)數(shù)）為100，感染96h后轉(zhuǎn)染效率可達(dá)70％左右。
　　 3熒光定量PCR及WesternBlotting檢測:培養(yǎng)第7、14天，實(shí)驗(yàn)組A-E三個(gè)目的基因都有表達(dá)，F(xiàn)空白對照組無表達(dá)。A組、C組SOX-9、Aggrecan、TypeⅡcollagen的表達(dá)水平分別高

7、于加細(xì)胞因子IL-1β的B、D組及空載體組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;D組目的基因表達(dá)水平較B組為高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);A組和C組間目的基因表達(dá)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論
　　 1BMSCs是軟骨組織工程理想的種子細(xì)胞，培養(yǎng)法方法簡便，易取材及體外擴(kuò)增，體外培養(yǎng)性能穩(wěn)定。密度梯度離心法結(jié)合全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)出的BMSCs活力旺盛，易于傳代。在一定誘導(dǎo)條件下，BMSCs可以定向分化為軟骨細(xì)胞。
　　 2利用慢