脂質(zhì)體介導(dǎo)TGF-β1基因轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文旨在進(jìn)行脂肪干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及富血小板血漿PRP誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞成骨作用進(jìn)行鑒定；并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，以TGF-β1目的基因修飾脂肪干細(xì)胞，使其向軟骨方向分化；將TGF-β1目的基因修飾脂肪干細(xì)胞在藻酸鹽載體中進(jìn)行立體培養(yǎng)：進(jìn)行TGF-β1目的基因修飾脂肪干細(xì)胞復(fù)合藻酸鹽在裸鼠體內(nèi)異位軟骨生成的實(shí)驗(yàn)，為基因修飾的組織工程軟骨的構(gòu)建和其實(shí)際應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料：成年雄性Wistar大鼠，SPF

2、級(jí)裸鼠4只由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。 二、實(shí)驗(yàn)方法： 1、脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)。取成年雄性Wistar大鼠腹股溝處脂肪組織，仔細(xì)清除包裹脂肪組織的假包膜以及深入脂肪組織的血管、結(jié)締組織，在超凈工作臺(tái)中，將組織剪碎，加入0.25％的Ⅰ型膠原酶，37℃、攪拌3h，加入兩倍體積的D-Hank’s，1200rpm，離心5mi．n，含15％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋，紗巾過(guò)濾，離心，將細(xì)胞收集到1-2瓶50 m1培養(yǎng)瓶中

3、培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)滿80％用0.125％/EDTA胰酶消化傳代培養(yǎng)。 2、CD44免疫細(xì)胞化學(xué)染色。取第2代脂肪干細(xì)胞爬片行CD44的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，Ⅰ抗：兔抗CD44抗體(1：100)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的Ⅱ抗(1；40)，熒光顯微鏡下觀察。對(duì)照組不加Ⅰ抗用PBS代替，其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。 3、PRP的制備。經(jīng)同一大鼠腹主動(dòng)脈抽取全血10ml(預(yù)先加入10％枸櫞酸鈉抗凝劑)，以1500r/miniig度離心10min，吸取上層血漿

4、及血小板，再以3000rpm速度離心10min，其沉淀即為PRP。對(duì)全血及PRP進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，確保PRP中血小板的數(shù)量是全血的4倍以上。將1 ml PRP加入98ml DMEM培養(yǎng)基中，同時(shí)加入1ml含5000 U牛凝血酶的100g/L CaCl<,2>溶液，即為含10ml/L PRP的DMEM條件培養(yǎng)基。 4、MTT檢測(cè)PRP對(duì)脂肪干細(xì)胞增殖的影響。 5、堿性磷酸酶(ALP)組織化學(xué)染色。取10ml/L PRP的DM

5、EM條件培養(yǎng)基培養(yǎng)14d的細(xì)胞爬片，10％中性福爾馬林固定10 min，堿性磷酸酶(ALP)改良Kaplow氏法染色． 6、ALP活性測(cè)定。將第2代脂肪干細(xì)胞以5×10<'4>/孔的密度接種96孔板中，含10ml/L PRP的DMEM條件培養(yǎng)基培養(yǎng)7，14，21，28d后，ALP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALP活性。第2代脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)7，14，21，28d分別測(cè)ALP活性作對(duì)照。 7、茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)。取成骨誘導(dǎo)14d的細(xì)胞爬片，

6、PBS漂洗，95％酒精固定5分鐘，2％茜素紅染液染色5分鐘，PBS沖洗兩遍。 8、TGF-β1基因轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞及陽(yáng)性細(xì)胞克隆株的篩選。選取第2代脂肪干細(xì)胞，5×10<'5>細(xì)胞傳至35ram單皿中，37℃， 5％CO<,2>培養(yǎng)至細(xì)胞密度為90％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine2000使用說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h后更換完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染一天后，將細(xì)胞按1：10的稀釋比例傳代至新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)液中，第二天加入G418 400

7、μ g/ml進(jìn)行篩選。篩選21d后克隆形成，將其挑至24孔板，生長(zhǎng)至融合轉(zhuǎn)移至6孔板，最后轉(zhuǎn)至50ml培養(yǎng)瓶中。 9、RT-PCR檢測(cè)。TGF-β1、FN、ColⅡ、Aggrecan、MMP-1、MMP-2、MMP-3 mRNATGF-β1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞棄培養(yǎng)液，每50ml培養(yǎng)瓶中加1 ml Trizol，按Trizol試劑盒用一步法提取總RNA，用DNA/RNA測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入Mgcl<,2>

8、2μl、10×RT Buffer 1μl、RNase Free dH<,2>O 3.75 μl、dNTPMixture(各10mM)1μl、RNase inhibitor 0.25 μl、Reverse TranscriDtase 0.5μl、Random 9 mers 0.5 μl、樣品RNA 1μl。反應(yīng)條件：30℃ 10min，42℃ 30min，99℃5min。5℃5min。 PCR反應(yīng)條件：94℃ 2min 94℃ 3

9、0sec 50-65℃ 30sec 72℃ imin 32個(gè)循環(huán)72℃延伸7min。用內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄效率。PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶(EB)顯色。用GDS8000凝膠自動(dòng)成像儀進(jìn)行攝像分析。用DL2000 Marker為分子大小對(duì)照確定陽(yáng)性電泳條帶。 10、Western blot檢測(cè)。TGF-β1RIPA buffer 200 μl裂解標(biāo)本；采用Folin-酚試劑法進(jìn)行蛋白定量；聚

10、丙烯酰胺凝膠電泳；硝酸纖維素膜(Millipore，USA)轉(zhuǎn)膜2h，加入TGF-β1兔多克隆抗體(1：400，Santa Cruz)和β-actin兔多克隆抗體(1：400，Santa Cruz)，4℃過(guò)夜。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔單克隆二抗，室溫孵育2h，堿性磷酸酶顯色15 min，于自動(dòng)電泳凝膠成像分析系統(tǒng)下成像。 11、掃描電鏡觀察TGF-β1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在藻酸鹽凝膠中的生長(zhǎng)情況。將TGF-β1基因轉(zhuǎn)染后的脂肪干細(xì)胞

11、細(xì)胞懸液以1×10<'6>個(gè)/ml的細(xì)胞濃度與藻酸鈉混勻后滴入Cacl<,2>溶液，邊滴入邊攪拌直到形成均勻的凝膠，將凝膠在15％FBS高糖-DMEM培養(yǎng)一周。無(wú)細(xì)胞的藻酸鹽凝膠做為對(duì)照。S-450日立掃描電鏡觀察。 12、細(xì)胞藻酸鈉復(fù)合體甲苯胺蘭染色觀察。TGF-β1基因轉(zhuǎn)染后的脂肪干細(xì)胞復(fù)合藻酸鈉培養(yǎng)一周后，進(jìn)行壓片，甲苯胺蘭染色觀察。 13、構(gòu)建組織工程化軟骨將準(zhǔn)備好TGF-β1基因轉(zhuǎn)染后的脂肪干細(xì)胞懸液以5×10

12、<'6>個(gè)/ml的細(xì)胞濃度與藻酸鈉混勻后滴入Cacl <,2>溶液，邊滴入邊攪拌直到形成均勻的凝膠，之后將凝膠注入裸鼠(4只裸鼠由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供)背部皮下一側(cè)，另一側(cè)注入無(wú)細(xì)胞的藻酸鹽凝膠作為對(duì)照。分別于4周、8周取材進(jìn)行HE、Masson染色、Ⅱ型膠原免疫組化檢測(cè)。 14、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±S表示，應(yīng)用SPSS醫(yī)用軟件統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 研究結(jié)果： 原代培養(yǎng)細(xì)胞第二天貼壁，7-10d長(zhǎng)滿，倒置顯

13、微鏡下見細(xì)胞呈纖維樣，各代細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，傳30代后細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)速度仍無(wú)明顯改變。脂肪干細(xì)胞的CD44免疫熒光染色呈陽(yáng)性。MTT檢測(cè)結(jié)果：相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。PRP誘導(dǎo)14天，ALP染色明顯陽(yáng)性。 ALP活性檢測(cè)顯示誘導(dǎo)組與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.01)。茜素紅染色顯示誘導(dǎo)14天可見鈣結(jié)節(jié)形成。 RT-PCR結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組(TGF β1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組)的TGF β1、FN、ColⅡ、A

14、ggrecan、MMP-2mRNA的表達(dá)較空染組和正常對(duì)照組均明顯增多，而MMP-1mRNA的表達(dá)較空染組和正常對(duì)照組均明顯減少(P<0.01)，MMP-3mRNA的表達(dá)較空染組和正常對(duì)照組亦明顯減少(P<0.05)Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組(TGF β1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組)TGF β1蛋白的表達(dá)較空染組和正常對(duì)照組均明顯增多(P<0.01)。 掃描電鏡觀察可見藻酸鹽凝膠呈網(wǎng)格狀，由許多孔隙，TGF-β1基因修飾的ATSCs在凝

15、膠的孔隙中生長(zhǎng)良好，并有基質(zhì)分泌。細(xì)胞藻酸鈉復(fù)合體甲苯胺蘭染色觀察：TGF-β1基因修飾的ATSCs甲苯胺蘭染色陽(yáng)性，可見細(xì)胞分裂相。 組織學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)組4周后切片觀察，植入物內(nèi)含有大量的萎縮成團(tuán)的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)并不完全一致。細(xì)胞間基質(zhì)較多且松散，有部分凝膠未吸收。Masson染色顯示較大區(qū)域藍(lán)色的軟骨基質(zhì)，包裹軟骨樣細(xì)胞。術(shù)后8周，實(shí)驗(yàn)組在植入?yún)^(qū)內(nèi)新生軟骨組織逐漸融合成片，支架基本完全吸收，Masson染色發(fā)現(xiàn)位于陷窩內(nèi)的軟骨

16、樣細(xì)胞，可見細(xì)胞分裂相，以及細(xì)胞周圍大片藍(lán)色基質(zhì)，為典型的軟骨樣結(jié)構(gòu)。術(shù)后4周和8周，組織Ⅱ型膠原免疫組化呈陽(yáng)性表達(dá)。 研究結(jié)論： 1、成功地分離大鼠的脂肪干細(xì)胞(ATSCs)，細(xì)胞表面標(biāo)志CD44呈現(xiàn)陽(yáng)性。 2、富血小板血漿(PRP)能夠促使ATSCs向成骨細(xì)胞分化。 3、以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將TGF-β1目的基因成功轉(zhuǎn)染ATSCs，轉(zhuǎn)染后成軟骨分化的特異性細(xì)胞外基質(zhì)增多，表明TGF-β1可以促使ATSCs向