TGF-β-,1-和IGF-1共同轉染大鼠BMSCs向軟骨細胞分化的實驗研究.pdf

1、試驗目的： 探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的分離、培養(yǎng)及表型鑒定方法。研究單獨或共同應用TGF-β1和IGF-1基因轉染大鼠BMSCs后，比較目的基因的分泌情況及向軟骨細胞分化效果，為構建新型組織工程軟骨種子細胞提供新思路。 試驗方法： 擴增、提取質(zhì)粒peDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-TGF-β1，酶切、電泳鑒定并測序。將密度梯度離心法和貼壁分離法相結合，分離、純化Wistar大鼠BMSCs，

2、倒置相差顯微鏡觀察原代和傳代BMSCs的形態(tài)學改變，免疫熒光法檢測細胞表面標志。將TGF-β1和IGF-1基因單獨和共轉染BMSCs，按轉染情況分為5組：未轉染組(A組)、轉染空載體組(B組)、轉染TGF-β1組(C組)、轉染IGF-1組(D組)、TGF-β1加IGF-1共轉染組(E組)。對轉染后細胞進行篩選，MTT法測定篩選后細胞的增殖活性，RT-PCR和Western blot法檢測篩選后細胞的表達。 結果： 電泳顯

3、示IGF-1和TGF-β1兩目的基因條帶，基因測序與GenBank cDNA序列相符。大鼠BMSCs原代細胞接種24 h后可見少量貼壁突起細胞，4、5 d開始形成典型的BMSCs簇狀增生灶，9、10 d細胞塵長即可達80％～90％融合。傳代后細胞的形態(tài)比較均一。轉染24 h后有少量細胞死亡，篩選3周后細胞細胞克隆形成，至第4周時細胞可進行傳代，多數(shù)細胞變成多邊形，部分細胞邊界不清，呈圓形，核偏位，核周顆粒明顯。免疫熒光法檢測BMSCs的

4、CD29、CD44呈陽性反應，CD34、CD45呈陰性反應。MTT法測定各組細胞在490 nm波長處的A值，分別為：A組0.432±0.038、B組0.428±0.041、C組0.664±0.086、D組0.655±0.045E組0.833±0.103。A、B組與C、D、E組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，A、B組間和C、D、E組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。RT-PCR和Western blot檢測目的基因和蛋白的表達量，T

5、GF-β1表達以C組最多，分別為0.925±0.022 0、124.341 7±2.982 0，E組次之，分別為0.771 7±0.012 0、101.766 7±1.241 0(P<0.01)；IGF-1的表達以E組最多，分別為1.020 0±0.026 0、128.171 7±9.152 0，D組次之，分別為0.465 0±0.042 0、111.045 0±6.248 0(P<0.01)；Ⅱ型膠原的表達以E組最多，分別為0.980

6、 0±0.034 0、120.355 0±12.550 0，C組次之，分別為0.720 0±0.0260、72.246 7±7.364 0(P<0.01)。 結論： 以脂質(zhì)體介導法能將TGF-β1和IGF-1目的基因?qū)隡SCs建立穩(wěn)定表達，轉染后MSCs在自身分泌合成的TGF-β1和IGF-1作用下，軟骨細胞外特異性基質(zhì)蛋白Collagen Ⅱ增多，同時MSCs細胞增殖代謝活力明顯增強，提示TGF-β1基因修飾MSCs