流體靜壓力和TGF-β3誘導(dǎo)大鼠骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的：
　　 初步探討流體靜壓力和轉(zhuǎn)化生長因子-β3(transforminggrowthfactor-β3，TGF-β3)在誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)向軟骨細(xì)胞分化過程中的相互作用，研究其分化機(jī)制，為MSCs定向分化的調(diào)控奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 取健康雄性SD大鼠的骨髓，貼壁法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(r-MSCs)，采用MTS法測(cè)定細(xì)胞的增殖曲線，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面抗原。取第四代MS

2、Cs，采用三維藻酸鹽凝珠培養(yǎng)體系，行Hoechst333258/PI熒光染色和AnnexinV/PI直標(biāo)雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞活性。轉(zhuǎn)化生長因子β3(TGF-β3)和(或)流體靜壓力誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞特征方向分化。采用組織化學(xué)染色和Realtime熒光定量RT-PCR測(cè)定轉(zhuǎn)錄因子SOX9、特異性細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原(collageⅡ)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)分成3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，分別為：TGF-β3(10n

3、g/ml)；靜壓力組(100kPa，4h/d)；TGF-β3和靜壓力聯(lián)合組和對(duì)照組(不添加任何生長因子和靜壓力)。各組于誘導(dǎo)的第7天，分別進(jìn)行HE染色，甲苯胺藍(lán)染色及PAS染色(PeriodicAcid-Schiffstain)；于誘導(dǎo)第1、3和7天分別提取各組細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)Sox9，COLⅡ和AGG的表達(dá)量。
　　 結(jié)果：
　　 本研究成功地分離、純化、培養(yǎng)了r-MSCs，原代和傳代細(xì)胞呈貼壁

4、生長，細(xì)胞狀態(tài)良好，為長梭形。第2、3、4代r-MSCs細(xì)胞表面抗原流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果為：CD29、CD90陽性(≥80％、≥98％、≥98％)，CD11、CD45陰性(≤2.0％、≤0.4％、≤0.2％)。MTS法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：第1、3、5代r-MSCs的生長曲線相似，傳代后2天細(xì)胞處于潛伏期，第4～6天進(jìn)入對(duì)數(shù)增殖期，第8天后進(jìn)入平臺(tái)期。倒置顯微鏡觀察藻酸鹽凝珠內(nèi)的MSCs，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，胞體透亮，分布均勻。隨著培養(yǎng)時(shí)

5、間的增加，局部可見細(xì)胞增殖的團(tuán)簇。Hoechst333258/PI熒光染色結(jié)果：藻酸鹽凝珠內(nèi)大部分細(xì)胞呈低藍(lán)色熒光，核呈正常結(jié)構(gòu)，隨培養(yǎng)時(shí)間的增加未見明顯核呈紅色熒光的細(xì)胞增多。AnnexinV/PI直標(biāo)雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果：對(duì)照組、壓力組和細(xì)胞因子組細(xì)胞包裹于藻酸鹽凝珠培養(yǎng)7天后，存活率較高，分別為79.7％，71.4％和89.4％。組織切片HE染色：對(duì)照組，TGF-β3組，壓力組和TGF-β3+壓力組的凝珠內(nèi)細(xì)胞呈圓形或橢圓形，分

6、布均勻，細(xì)胞皺縮狀，周圍為空腔，形似軟骨陷窩。甲苯胺藍(lán)染色和PAS染色：TGF-β3，壓力，TGF-β3+壓力組結(jié)果陽性，證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后細(xì)胞呈現(xiàn)軟骨細(xì)胞特征。RT-PCR結(jié)果表明TGF-β3，壓力，TGF-β3+壓力組細(xì)胞在誘導(dǎo)1、3、7天后均有Sox9、COLⅡ和AGG表達(dá)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，各組Sox9和COLⅡ基因的表達(dá)量隨培養(yǎng)時(shí)間的增加呈不同程度的增加。第3、7天的Sox9、COLⅡ和AGGmRNA表達(dá)水平較對(duì)照組高

7、，其中TGF-β3+壓力組的Sox9基因表達(dá)量，壓力組和TGF-β3+壓力組的COLⅡ基因表達(dá)量，TGF-β3和TGF-β3+壓力組的AGG基因表達(dá)量顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≤0.05)。另外，藻酸鹽凝珠培養(yǎng)第三天，TGF-β3+壓力組的COLⅡ和AGG基因的表達(dá)水平明顯高于單純TGF-β3組和壓力組(P≤0.01)，說明壓力和細(xì)胞因子的聯(lián)合作用能獲得更為顯著的效果。
　　 結(jié)論：
　　 藻酸鹽凝珠作為r-MSCs三