關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的：(1)分離、培養(yǎng)及鑒定骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone MarrowMesenchymal Stem Cells，BMSCs)，并獲取高純度的BMSCs；(2)分離、培養(yǎng)及鑒定關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(Articular Cartilage Cells，ACs)，并獲取高純度的ACs；(3)BMSCs與ACs共同培養(yǎng)誘導(dǎo)，并檢測(cè)其誘導(dǎo)結(jié)果；(4)對(duì)共培養(yǎng)生物誘導(dǎo)與TGF-β1化學(xué)誘導(dǎo)的結(jié)果進(jìn)行比較。
　　 方法：(1)獲取并培養(yǎng)、增殖高

2、純度骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：從SD大鼠(4周齡)的股骨及脛骨干中取得骨髓，聯(lián)合利用密度梯度離心法及差異貼壁法分離、純化BMSCs，體外擴(kuò)增并傳代后，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記：CD29、CD90、CD34及CD45，再通過(guò)成脂肪樣、成骨樣及成神經(jīng)樣細(xì)胞多向分化誘導(dǎo)，檢測(cè)其誘導(dǎo)結(jié)果，確定所得細(xì)胞為BMSCs，為下一步實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。(2)獲取并培養(yǎng)、增殖高純度的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞：從SD大鼠(4周齡)的正常股骨頭表面取得關(guān)節(jié)

3、軟骨片，先后運(yùn)用0.25％的胰蛋白酶和0.2％Ⅱ型膠原酶消化軟骨片，當(dāng)相差顯微鏡下見有大量軟骨細(xì)胞游離后，離心、棄上清液，加入含15％FBS的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增傳代，并取樣行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。當(dāng)細(xì)胞傳至第三代時(shí)，運(yùn)用甲苯胺藍(lán)染色及HE染色檢查、鑒別該細(xì)胞，確定所得細(xì)胞為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，為下一步實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。(3)BMSCs與ACs在Transwell共培養(yǎng)：分別吸取第三代BMSCs和ACs，按1∶1的細(xì)胞比例分別植于Transwe

4、ll共培養(yǎng)系統(tǒng)中，下室植入BMSCs，上室植入ACs，同時(shí)設(shè)置相同濃度單獨(dú)BMSCs空白對(duì)照組，分別在用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的增殖和基質(zhì)合成情況，并對(duì)各組細(xì)胞爬片進(jìn)行Ⅱ型膠原免疫組化染色檢查。(4)共培養(yǎng)生物誘導(dǎo)與TGF-β1化學(xué)誘導(dǎo)的比較：將BMSCs用于TGF-β1(10 ng/m1)誘導(dǎo)，同時(shí)與1∶2，1∶1，2∶1(關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞：BMSCs)濃度的細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)組比較對(duì)照。并運(yùn)用MTT比色

5、法檢查、氨基聚糖(GAG)含量檢測(cè)及WESTERN BLOT檢測(cè)各組細(xì)胞Ⅱ型膠原基因表達(dá)量，確定其誘導(dǎo)情況。
　　 結(jié)果：(1)獲取并培養(yǎng)、增殖高純度BMSCs：相差顯微鏡下觀察結(jié)果：原代細(xì)胞接種12h后可見部分細(xì)胞貼壁，24h后細(xì)胞大量貼壁，外觀呈現(xiàn)紡錘形或多角形。72h后細(xì)胞數(shù)量開始增多，大部分細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形、似成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)10d左右細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底達(dá)80％左右，細(xì)胞呈極性排列，部分集落可呈漩渦狀。細(xì)胞表面標(biāo)記物經(jīng)流式

6、細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果：BMSCs均一地表達(dá)CD29及CD90，陽(yáng)性率分別為92.5％及94.4％；而CD34和CD45為陰性，陰性率分別為99.3％和99.7％。成脂肪樣、成骨樣及成神經(jīng)樣細(xì)胞誘導(dǎo)均獲得成功。(2)獲取并培養(yǎng)高純度的ACs：運(yùn)用上述方法可獲得一定純度的ACs。在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：軟骨細(xì)胞接種12h后開始貼壁，48h完成貼壁。原代培養(yǎng)的ACs呈圓形及多角形，胞漿豐富，胞核圓形，居中，細(xì)胞長(zhǎng)成一片可呈明顯的鋪路石樣外觀，與

7、長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞較易區(qū)分。試驗(yàn)證明：經(jīng)本方法消化培養(yǎng)后僅見單一的軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)。(3)BMSCs與ACs共培養(yǎng)：共培養(yǎng)組BMSCs數(shù)量增多，細(xì)胞外基質(zhì)合成豐富，其基質(zhì)能被Ⅱ型膠原免疫組化染色，細(xì)胞染色呈現(xiàn)黃色。(4)共培養(yǎng)生物誘導(dǎo)與TGF-β1化學(xué)誘導(dǎo)的比較：共培養(yǎng)細(xì)胞生物誘導(dǎo)的MTT比色法檢查、氨基聚糖(GAG)含量檢測(cè)及Ⅱ型膠原WESTERN BLOT檢測(cè)結(jié)果顯示：各組細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)結(jié)果均不差于TGF-β110ng/m的1化學(xué)誘導(dǎo)結(jié)