骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中的非造血干細(xì)胞，具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能。在不同的條件下可以誘導(dǎo)分化為多個(gè)細(xì)胞系，包括成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞還具有取材方便，對(duì)機(jī)體損傷小，體外培養(yǎng)增殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，選用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行組織再生或移植，不僅沒有移植排異反應(yīng)，還避免了倫理紛爭(zhēng)。因此，對(duì)骨

2、髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也被認(rèn)為是最有前途的組織工程的種子細(xì)胞。 1 BMSCs的分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性為了建立一個(gè)有效的分離培養(yǎng)，體外擴(kuò)增的方法，本實(shí)驗(yàn)比較了三種常用的分離培養(yǎng)方法，結(jié)果顯示用Percoll淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行不連續(xù)密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)BMSCs的體外擴(kuò)增和純化。將得到的BMSCs在倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)，發(fā)現(xiàn)90％以上的細(xì)胞表現(xiàn)為

3、BMSCs典型形態(tài)。用MTT法描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線證實(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，且增殖狀況與接種密度有關(guān)。用流式細(xì)胞儀鑒定第5和20代細(xì)胞表型，CD29、CD90、CD44、CD106、CD71表現(xiàn)為陽性，CD34、CD45為陰性，證明BMSCs穩(wěn)定傳至20代，表型沒有變化。 2 BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化常用的誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方案是將成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basicfibroblast growth factor,b

4、FGF)、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、丁羥基茴香醚(butyl hydroxy anisol，BHA)聯(lián)用。本實(shí)驗(yàn)BMSCs分別用(1)bFGF+DMSO+BHA；(2)bFGF+DMSO；(3)DMSO+BHA；(4)DMSO四種不同的誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)用(1)誘導(dǎo)的BMSCs在29小時(shí)內(nèi)有80％左右變成神經(jīng)樣細(xì)胞，而其他三組則需更長(zhǎng)的時(shí)間。同時(shí)使用方案(1)時(shí)，細(xì)胞形態(tài)變化較其他三組變化更快，更明

5、顯。這四組誘導(dǎo)得到神經(jīng)樣細(xì)胞均可以表達(dá)神經(jīng)特異性標(biāo)志neuron-specific enolase(NSE)。用方案(1)29 h可以得到80％細(xì)胞陽性，而此時(shí)其他各組基本為陰性表達(dá)。使用方案(2)(3)(4)需要32 h左右可以觀察到BMSCs形態(tài)變化成神經(jīng)元樣，免疫熒光染色約80％陽性。將各組誘導(dǎo)后的細(xì)胞繼續(xù)用無血清L-DMEM培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)用(3)(4)兩種方案誘導(dǎo)得到的細(xì)胞出現(xiàn)老化死亡現(xiàn)象。為了檢測(cè)這些神經(jīng)特異標(biāo)志在：BMS

6、Cs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程中的表達(dá)，將BMSCs用含血清和bFGF的L-DMEM預(yù)誘導(dǎo)24 h，然后用含有DMSO和BHA的無血清L-DMEM繼續(xù)誘導(dǎo)。在這個(gè)過程中發(fā)現(xiàn)nestin的表達(dá)要早于NSE和β-tubulin的表達(dá)，因?yàn)閚estin是神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志，而后兩者是神經(jīng)元的標(biāo)志。 最后，將BMSCs和用其誘導(dǎo)分化成的神經(jīng)樣細(xì)胞預(yù)先用BrdU標(biāo)記，然后局部移植入脊髓橫斷的動(dòng)物模型體內(nèi)，用BBB評(píng)分來評(píng)價(jià)術(shù)后1-12 w動(dòng)物的行

7、為表現(xiàn)及功能恢復(fù)情況。結(jié)果顯示移植細(xì)胞的動(dòng)物整體功能恢復(fù)情況要好于對(duì)照組。用免疫組化法對(duì)橫斷部位脊髓切片染色也發(fā)現(xiàn)許多BrdU陽性的細(xì)胞。 3 BMSCs向成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化為了檢測(cè)不同誘導(dǎo)起始時(shí)間對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的影響，開展了如下工作。分別在(1)BMSCs接種當(dāng)時(shí)，(2)50-60％融合時(shí)，(3)85-95％融合時(shí)加入成骨誘導(dǎo)劑開始誘導(dǎo)。倒置相差顯微鏡下觀察增殖分化情況，分別進(jìn)行堿性磷酸酶染色(鈣鈷染色)

8、和鈣結(jié)節(jié)染色(von kossa染色)。誘導(dǎo)過程中可以觀察到BMSCs逐漸向成骨細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，堿性磷酸酶染色和鈣結(jié)節(jié)染色呈現(xiàn)陽性。結(jié)果顯示在BMSCs 85-95％融合時(shí)開始誘導(dǎo)的細(xì)胞堿性磷酸酶和鈣結(jié)節(jié)染色陽性率更高而堿性磷酸酶活性增強(qiáng)更明顯。 為了評(píng)估不同傳代倍數(shù)的BMSCs成骨誘導(dǎo)分化能力的高低，將5、10、15、20四代細(xì)胞同時(shí)開始向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)這四代細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞的能力沒有明顯不同。 本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究