TGF-β-,1-基因修飾的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合PLGA構(gòu)建組織工程化軟骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一章真核表達(dá)載體pcDNA3.1-TGF-β1質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 目的：探討真核表達(dá)載體pcDNA3.1-TGF-β1質(zhì)粒的構(gòu)建方法，并初步研究其轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的可行性。 方法：利用基因重組技術(shù)，將大鼠TGF-β1全長(zhǎng)基因的PCR產(chǎn)物與克隆載體pT7Blue連接，并用大腸桿菌篩選陽性重組體構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，采用XboⅠ、HindⅢ雙酶切及測(cè)序方法對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行鑒定；將已經(jīng)純化的pcDNA3.1-TGF-β1質(zhì)粒和空載體

2、pcDNA3.1質(zhì)粒分別采用陽離子脂質(zhì)體試劑LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染ADSCs，經(jīng)G418抗性篩選后擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)用pcDNA3.1-GFP觀察轉(zhuǎn)染效率，采用RT-PCR和Western-blot檢測(cè)被轉(zhuǎn)染的ADSCs中TGF-β1的表達(dá)情況。 結(jié)果：重組質(zhì)粒經(jīng)Xbo Ⅰ、HindⅢ雙酶切后出現(xiàn)1.35bp和5.4kb兩條帶，測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒所包含的TGF-β1全長(zhǎng)堿基序列完全正確，GFP顯示其轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)

3、胞的轉(zhuǎn)染效率>80％，且轉(zhuǎn)染細(xì)胞后有TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：利用基因重組技術(shù)可成功構(gòu)建能轉(zhuǎn)染ADSCs的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-TGF-β1質(zhì)粒。 第二章 TGF-β1基因轉(zhuǎn)染的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外成軟骨的研究 目的：探討TGF-β1基因?qū)DSCs體外定向成軟骨分化能力的作用。 方法：分離、培養(yǎng)大鼠ADSCs，pcDNA3.1-TGF-β1轉(zhuǎn)染其第四代細(xì)胞后置于含10％新生牛

4、血清、6.25μg/mL胰島素、6.25μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、10-7M地塞米松、50μg/mL維生素C的高糖DMEM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)、培養(yǎng)。同時(shí)將pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的ADSCs和單純ADSCs設(shè)為對(duì)照組；在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和形態(tài)變化；14天后應(yīng)用甲苯胺蘭染色、II型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色、aggrecan細(xì)胞免疫熒光評(píng)價(jià)細(xì)胞的成軟骨能力；0周、2周和4周采用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Col2al、Sox9和TGF-β1mRNA的表達(dá)

5、情況，并用Western-blot檢測(cè)Col2a1及Agcl蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果：TGF-β1轉(zhuǎn)染組的ADSCs在初期時(shí)生長(zhǎng)較對(duì)照組慢，24～48小時(shí)后生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞形態(tài)由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)槿切位蚨噙呅危?4天后細(xì)胞爬片經(jīng)甲苯胺蘭染色和II型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽性，經(jīng)aggrecan細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)見細(xì)胞的胞漿、胞膜均有綠色熒光表達(dá)，而對(duì)照組則僅維持貼壁生長(zhǎng)，其標(biāo)本在14天后經(jīng)甲苯胺蘭染色、II型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色和a

6、ggrecan細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)，其結(jié)果均為陰性；同時(shí)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)0周，2周，4周時(shí)轉(zhuǎn)染組標(biāo)本中Col2al、TGF-β1和Sox9 mRNA的表達(dá)水平逐漸上調(diào)，而對(duì)照組中Col2al、TGF-β1和Sox9 mRNA的表達(dá)低，轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；Westem-blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組中Col2al和Agcl的蛋白表達(dá)水平在0周，2周，4周時(shí)也逐漸上調(diào)，轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組之間的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0

7、.05)。 結(jié)論：真核表達(dá)載體pcDNA3.1-TGF-β1轉(zhuǎn)染ADSCs后可獲得TGF-β1的高效表達(dá)，并可促進(jìn)體外培養(yǎng)的ADSCs定向分化為軟骨細(xì)胞。 第三章TGF-β1基因表達(dá)的ADSCs復(fù)合PLGA支架材料在體內(nèi)構(gòu)建組織工程化軟骨研究 目的：探討TGF-β1基因表達(dá)的ADSCs復(fù)合PLGA支架材料在體內(nèi)構(gòu)建組織工程化軟骨的可行性。 方法：在體外將真核表達(dá)載體pcDNA3.1-TGF-β1修飾的AD

8、SCs與PLGA支架材料復(fù)合，培養(yǎng)24h后將該復(fù)合物種植在裸鼠皮下，從形態(tài)學(xué)上初步評(píng)價(jià)構(gòu)建組織工程化軟骨的程度；4周時(shí)從裸鼠皮下提取標(biāo)本行掃描電鏡觀察；于12周時(shí)取出移植物標(biāo)本行組織學(xué)染色及II型膠原蛋白免疫組織化學(xué)染色；同時(shí)，用RT-PCR檢測(cè)4周、8周和12周時(shí)標(biāo)本中Col2al、Sox9和TGF-β1mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果：細(xì)胞/材料復(fù)合體植入裸鼠皮下后，裸鼠生長(zhǎng)良好，傷口一期愈合；包塊基本保持植入時(shí)的形態(tài)，但包塊質(zhì)地

9、有所增韌，而對(duì)照組形成的包塊則逐步縮小、松軟，直至消失；掃描電鏡觀察見4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均有細(xì)胞在材料表面附著生長(zhǎng)，但實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)更旺盛，形成的基質(zhì)也最為明顯；12周時(shí)移植物標(biāo)本經(jīng)H-E染色、甲苯胺蘭染色、藩紅O/固綠染色和II型膠原蛋白免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果均呈陽性；RT-PCR檢測(cè)顯示4周、8周和12周時(shí)實(shí)驗(yàn)組中Co12al和Sox9 mRNA表達(dá)逐漸上調(diào)，而TGF-β1 mRNA在8周時(shí)的表達(dá)水平較4周及12周時(shí)高，各時(shí)間點(diǎn)檢