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文檔簡介
1、第一部分成人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和鑒定目的本實驗擬通過體外細胞培養(yǎng)的方法,將間充質(zhì)干細胞自骨髓血中分離出來,并加以純化、鑒定,進一步在體外的培養(yǎng)條件下研究其增殖及生長的特性,從而探討為組織工程化血管研究提供種子細胞的可能性。 方法收集成人骨髓血,采用密度梯度離心和貼壁生長的方式,提取單個核細胞進行體外培養(yǎng);收集第2~3代(P2~P3)細胞行流式細胞儀檢測細胞抗原表達(CD34、CD45、CD11a,CD14、KDR、CD105
2、、HLADR);采用細胞計數(shù)的方法,繪制原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)細胞的生長曲線。 結(jié)論1.利用密度梯度離心和貼壁的方法可以獲取較高純度的BMMSCs;2.該BMMSCs具有大量增殖的功能,可滿足組織工程種子細胞的需要;3.BMMSCs表達CD105、KDR,不表達HLA-DR、CD34、CD45、CD11a、CD14。 第二部分骨髓間充質(zhì)干細胞定向誘導(dǎo)為血管平滑肌樣細胞、內(nèi)皮樣細胞的實驗研究目的本實驗通過誘導(dǎo)動物骨髓
3、間充質(zhì)干細胞向血管平滑肌樣細胞和血管內(nèi)皮樣細胞分化,通過形態(tài)學(xué)和相關(guān)抗原的鑒定,探討其作為血管壁種子細胞的可行性。 方法通過骨髓穿刺的方法獲取動物骨髓,采用密度梯度離心和貼壁生長的方式,提取單個核細胞進行體外培養(yǎng);取第2~4代(P2~P4)生長狀態(tài)良好的細胞,用含10-8mol/LAT-RA、0.5×10-3mol/Ldb-cAMP的DMEM-LG(15%FBS)培養(yǎng)液誘導(dǎo)、分化為血管平滑肌樣細胞;用含10ng/mLVEGF的培
4、養(yǎng)液誘導(dǎo)、分化為血管內(nèi)皮樣細胞;對所誘導(dǎo)、分化的細胞進行形態(tài)學(xué)觀察和相關(guān)抗原的免疫熒光鑒定。 結(jié)論1.骨髓間充質(zhì)干細胞可以在體外定向分化為具有平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞特性的細胞;2.所誘導(dǎo)的細胞可作為組織工程的種子細胞。 第三部分平滑肌樣細胞和膠原包埋PGA支架組織相容性的實驗研究目的本研究利用骨髓間充質(zhì)干細胞所誘導(dǎo)的平滑肌樣細胞種植在膠原包埋PGA支架的膜片上,進行細胞形態(tài)學(xué)觀察和細胞粘附、增殖的測定,進一步評價
5、其組織相容性。 方法利用SD大鼠提取鼠尾膠原,包埋PGA構(gòu)建復(fù)合支架;利用骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)血管平滑肌樣細胞;將單純PGA支架、膠原包埋的PGA支架用打孔器將其制作為直徑為6mm的小圓片,鋪于96孔板的板底。實驗分為膠原包埋PGA組、PGA組、單純細胞組和空白對照組。種植平滑肌樣細胞,分別進行HE染色、甲苯胺藍染色、電鏡掃描和MTT法檢測,評價平滑肌樣細胞和膠原包埋PGA的組織相容性。 結(jié)論1.細胞在膠原包埋PGA的支
6、架上生長良好;2.甲苯胺藍染色和MTT法可間接反映細胞在支架上的生長狀態(tài);3.HE染色和電鏡觀察結(jié)果可供參考。 第四部分體外構(gòu)建初級組織工程小口徑血管、體內(nèi)植入血管壁強化目的本實驗采用在動物體外構(gòu)建初級組織工程化血管、體內(nèi)強化的方法,探討組織工程技術(shù)構(gòu)建小口徑組織工程化血管的可能性,為進一步在具有免疫力的高等動物體內(nèi)構(gòu)建組織工程化血管組織并用其修復(fù)血管提供參考。 方法Brdu標記所有種子細胞,DAPI標記內(nèi)皮樣細
7、胞,觀察細胞標記的成功率;血管平滑肌樣細胞和血管內(nèi)皮樣細胞分層種植于膠原包埋PGA的復(fù)合支架表面;將細胞和支架的復(fù)合體種植于動物皮下,并設(shè)立對照組,分別于植入后的第4、6、8周再次麻醉動物,取出植入皮下的組織工程化血管,行組織學(xué)檢查及免疫熒光檢查等。 結(jié)論1.體外構(gòu)建的初級組織工程化血管,以動物的皮下為生物反應(yīng)器,采用靜態(tài)培養(yǎng)的方式可使血管壁得以強化,從而構(gòu)建出次級組織工程化血管;2.組織工程技術(shù)構(gòu)建的次級工程化血管組織其大體結(jié)
8、構(gòu)和與天然血管相似;3.血管壁細胞有所種植的種子細胞生長,并參與了組織工程化血管的重構(gòu)。 第五部分組織工程化血管在活體移植的動物實驗?zāi)康谋緦嶒炌ㄟ^體外構(gòu)建、體內(nèi)培養(yǎng)的方法構(gòu)建組織工程化血管,并將其植入動物的股動脈,研究利用小口徑組織工程化血管進行血管移植的可能性。 方法構(gòu)建組織工程化血管的方法同前;麻醉實驗動物(為細胞的供體動物),暴露股動脈,肝素鈉1mg/kg體重血管內(nèi)注射抗凝,切除長約3cm的一段股動脈,移
9、植組織工程化血管,分別于植入后1w、2w再次麻醉動物,取出移植的血管,行HE染色及免疫熒光等相關(guān)檢查,了解移植后血管的特點及細胞來源。同時設(shè)對照組,其移植物為單純支架組在皮下培養(yǎng)所形成的管狀結(jié)構(gòu)。 結(jié)論1.利用骨髓間充質(zhì)干細胞分化而來的種子細胞和膠原包埋的PGA支架可以構(gòu)建組織工程化小口徑血管,而且可以移植入動物體內(nèi);2.病理和免疫熒光檢查表明,該血管結(jié)構(gòu)和正常的血管組織結(jié)構(gòu)相似;3.免疫熒光檢查證實,其細胞來源主要為體外種植的
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