以人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程脂肪的實驗研究.pdf

1、目的：1.探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human Umhilical Cord Mesenchvmal Stem Cells hUCMSCs)的體外分離、純化及培養(yǎng)條件，并對其生物學(xué)特性進行研究；2.觀察hUCMSCs凍存復(fù)蘇后向脂肪細(xì)胞定向分化的能力；3.觀察蠶絲素多孔支架對hUCMSCs吸附作用及支架對hUCMSCs形態(tài)、功能及活性的影響，探討蠶絲素多孔支架與hUCMSCs構(gòu)建組織工程脂肪的可行性。 方法：1.將剔除動靜脈的新鮮

2、人臍帶組織切成小塊培養(yǎng)，得到貼壁細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計數(shù)繪制細(xì)胞生長曲線；流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面標(biāo)記；化學(xué)染色及RT-PCR檢測其體外誘導(dǎo)成脂和成骨分化的能力；RT-PCR檢測干細(xì)胞特異性標(biāo)志基因OCT-4；2.將第1代的hUCMSCs采用梯度冷凍技術(shù)凍存5個月，復(fù)蘇后培養(yǎng)至第12代時，加入成脂誘導(dǎo)劑培養(yǎng)。當(dāng)誘導(dǎo)至21天時行油紅O染色，7天及14天時用RT-PCR技術(shù)分別檢測成脂轉(zhuǎn)化基因過氧化物酶增殖劑受體(PPARγ-2

3、)和脂蛋白酯酶(LPL)；3.將hUCMSCs制成細(xì)胞懸液接種于蠶絲素多孔支架，熒光倒置相差顯微鏡、掃描電鏡和四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法觀察其在支架上的吸附和生長情況，將細(xì)胞-支架復(fù)合物成脂誘導(dǎo)6周后移植于大鼠體內(nèi)，觀察細(xì)胞在支架上成脂情況。 結(jié)果：1.體外培養(yǎng)4-6天后，有細(xì)胞從組織塊中游出；細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第10代，無明顯的形態(tài)和增殖能力改變；細(xì)胞陽性表達CD13、CD44，而CD14、CD34、HLA-DR表達呈陰性。體外誘

4、導(dǎo)實驗證實，該細(xì)胞具有成脂肪和成骨分化的能力。RT-PCR顯示其表達干細(xì)胞特異性因子OCT-4；2.hUCMSCs凍存復(fù)蘇后，活細(xì)胞約為86％，流式細(xì)胞儀分析這些細(xì)胞表達CD13、CD44和CD71等MSCs標(biāo)志物，不表達CD14、CD34和HLA-DR表面抗原。復(fù)蘇細(xì)胞在成脂誘導(dǎo)劑的作用下，細(xì)胞中有脂滴產(chǎn)生，通過油紅O染色顯示細(xì)胞核周圍有脂滴聚集，通過RT-PCR檢測有LPL及PPARγ-2 mRNA的表達。3.細(xì)胞與支架復(fù)合培養(yǎng)1-

5、2天后可見hUCMSCs與蠶絲素多孔支架充分附著，培養(yǎng)5-7天細(xì)胞生長增殖十分活躍，10天左右時，蠶絲支架孔中hUCMSCs成片狀融合。熒光倒置相差顯微鏡和掃描電鏡見細(xì)胞與支架黏附良好并有大量基質(zhì)分泌，且活性指標(biāo)與正常培養(yǎng)的hUCMSCs比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，細(xì)胞-支架復(fù)合物成脂誘導(dǎo)4周時，已有成脂樣細(xì)胞生成，并與蠶絲素蛋白多孔支架牢固粘附，成脂誘導(dǎo)6周，見大量成脂樣細(xì)胞生成；將成脂誘導(dǎo)6周的細(xì)胞-支架復(fù)合物植入大鼠體內(nèi)植入

6、4周后，可見有脂肪形成，8周后支架材料繼續(xù)降解，脂肪組織形成明顯，對照組支架材料逐漸降解，未見脂肪組織形成。 結(jié)論：1. hUCMSCs能在體外培養(yǎng)、擴增并且具有和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的生物學(xué)特性；2.將hUCMSCs凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)至第12代，仍具有向脂肪細(xì)胞分化的潛能，可作為脂肪組織工程的種子細(xì)胞來源；3.蠶絲素多孔支架對hUCMSCs具有良好的吸附作用，并能維持其正常形態(tài)、功能及活性，蠶絲素多孔支架是hUCMSCs三維立體培