剪應(yīng)力對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長狀態(tài)的影響及其作用機制的研究.pdf

1、研究背景：
　　相對于機械瓣膜和普通生物瓣膜來說，組織工程心臟瓣膜（TEHV）自身有很多優(yōu)點，但目前TEHV的最大缺點是植入人體后難以耐受高速高壓的血流沖擊，功能上難以滿足需要，且容易衰壞，使用壽命短。其主要原因是種子細(xì)胞如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）在高剪應(yīng)力下難以存活，不能對TEHV組織結(jié)構(gòu)進行保護和修復(fù)，因此提高高剪應(yīng)力條件下的細(xì)胞存活及改善其生長狀態(tài)研制TEHV的關(guān)鍵方向。
　　人體內(nèi)血流動力是瓣膜發(fā)育的重要起始信號

2、，并在瓣膜發(fā)育過程中通過力的大小變化對瓣膜組織結(jié)構(gòu)和功能進行調(diào)節(jié)[1-2]。從胚胎期至成人，人體內(nèi)的流體力是逐步增加的，因此研究漸進增加的流體力對TEHV種子細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)具有重要意義，并可能通過漸進增加的流體力訓(xùn)練從而實現(xiàn)TEHV對高速、高壓血流的耐受.
　　研究目的：
　　本課題研究漸進性增加的剪應(yīng)力對MSCs生長狀態(tài)的影響及其可能的作用機制，并研究漸進性增加剪應(yīng)力對MSCs進行流體力適應(yīng)性訓(xùn)練的結(jié)果。
　　研究

3、方法和結(jié)果：
　　第一部分：將大鼠MSCs在0、1、3、8、15dyn/cm2剪應(yīng)力水平分別作用24h，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)變化，并通過MTT、流式細(xì)胞技術(shù)、Hoechst/PI、透射電子顯微鏡等檢查方法觀察MSCs的生長狀態(tài)和凋亡、壞死情況。結(jié)果：1dyn/cm2剪應(yīng)力對MSCs無明顯影響，3dyn/cm2的剪應(yīng)力可以促進細(xì)胞生長，而8和15dyn/cm2的剪應(yīng)力促使細(xì)胞凋亡明顯增多。說明合適的剪應(yīng)力（3dyn/cm2）對細(xì)胞生長有

4、益，而細(xì)胞不能耐受高的剪應(yīng)力作用（8和15dyn/cm2）。
　　第二部分：以漸進增加的剪應(yīng)力作用于MSCs，設(shè)相應(yīng)的剪應(yīng)力高值為對照組，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)變化，通過MTT測定細(xì)胞增殖及活性，流式細(xì)胞技術(shù)測定細(xì)胞死亡百分比。取作用后的細(xì)胞培養(yǎng)基，以酶聯(lián)免疫吸附測定法（Elisa）檢測其中細(xì)胞生長因子bFGF、TGF-β1、PDGF、VEGF變化，根據(jù)生長因子濃度變化制作相應(yīng)的載藥納米微球，加入培養(yǎng)基。結(jié)果：漸進增加的剪應(yīng)力相較于恒定

5、高剪應(yīng)力（8和15dyn/cm2）顯著改善了細(xì)胞增殖及活力，降低了細(xì)胞死亡百分比，并且相較于高剪應(yīng)力組使細(xì)胞生長因子分泌水平升高。載藥納米微球的使用可以改善力作用后的細(xì)胞存活。說明漸進性力學(xué)訓(xùn)練可以改善MSCs對高剪應(yīng)力的耐受，改善因高剪應(yīng)力作用導(dǎo)致的細(xì)胞因子分泌減少，通過納米微球載生長因子緩釋系統(tǒng)可以增強力作用后的細(xì)胞存活。
　　第三部分：以0、1、3、8、15、1-15dyn/cm2的剪應(yīng)力作用于MSCs，通過Western方

6、法測定ERK磷酸化（P-ERK）以及JNK（c-JunN-terminalkinases）底物c-Jun的磷酸化水平，即P-c-Jun的水平。結(jié)果：高剪應(yīng)力（8和15dyn/cm2）減低了P-ERK，而增加了P-c-Jun的表達(dá)。而1-15dyn/cm2漸進性增加的剪應(yīng)力相較于高剪應(yīng)力可以升高P-ERK水平，降低細(xì)胞內(nèi)P-c-Jun的水平。說明剪應(yīng)力對MSCs的促生長、凋亡作用可能通過ERK和JNK通路進行。
　　第四部分：設(shè)計可

7、以模擬人體血流的仿生脈動生物反應(yīng)器。將1-15dyn/cm2漸進增加的剪應(yīng)力預(yù)訓(xùn)練過的MSCs種植于脫細(xì)胞的豬主動脈壁上（預(yù)訓(xùn)練組），對照組接種靜態(tài)培養(yǎng)的MSCs。將兩組均固定于體外脈動反應(yīng)器，在15dyn/cm2水平作用72h。取標(biāo)本進行蘇木素-伊紅染色（HE），同時以分光光度法和電泳測定組織內(nèi)DNA含量，以western方法檢測組織內(nèi)I型膠原含量。結(jié)果：研制成仿生脈動生物反應(yīng)器，可以輸出近似于心臟血液循環(huán)特征的搏動性血流，可持續(xù)穩(wěn)定

8、運轉(zhuǎn)72h。HE結(jié)果顯示在15dyn/cm2剪應(yīng)力作用72h后，訓(xùn)練組的MSCs在動脈壁內(nèi)留存較多，而對照組的MSCs從動脈壁基本脫落。分光光度法及電泳顯示訓(xùn)練組組織內(nèi)DNA含量明顯高于對照組。Western檢測I型膠原含量訓(xùn)練組明顯高于對照組。說明力學(xué)訓(xùn)練后的MSCs相對于靜態(tài)培養(yǎng)的MSCs接種于支架材料后可較好耐受高速、高壓流體力的作用。
　　結(jié)論：
　　本研究系統(tǒng)地研究了不同大小剪應(yīng)力對MSCs的作用，發(fā)現(xiàn)適度的剪應(yīng)力

9、（3dyn/cm2）促進MSCs生長，過低的剪應(yīng)力（1dyn/cm2）對MSCs生長無明顯影響,而過高剪應(yīng)力（8、15dyn/cm2）抑制MSCs生長并促使細(xì)胞死亡。首先提出了對MSCs進行漸進性增加剪應(yīng)力訓(xùn)練的概念，發(fā)現(xiàn)漸進性增加的剪應(yīng)力相較于恒定高剪應(yīng)力更容易被細(xì)胞耐受，細(xì)胞活力增強、存活比例增加、MSCs分泌細(xì)胞生長因子增加。探索了剪應(yīng)力對MSCs作用的機制，發(fā)現(xiàn)ERK和JNK通路可能參與剪應(yīng)力對細(xì)胞生長、凋亡的調(diào)控機制。將受剪應(yīng)