不同結(jié)構(gòu)納米纖維支架對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞行為的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、為了研究能應(yīng)用于椎間盤突出臨床實(shí)踐的組織工程仿生材料，本課題組前期對(duì)聚乳酸/聚已內(nèi)酯(Poly(L-Lactide)/Polycaprolactone，PLLA/PCL）材料進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示這種材料具有優(yōu)良的力學(xué)性能、有效的表面活性與降解速率可調(diào)控性等優(yōu)勢(shì)。為了繼續(xù)深入研究和優(yōu)化支架材料，使之向臨床應(yīng)用進(jìn)一步推進(jìn)，我們對(duì)PLLA/PCL材料配置比例及制作方法進(jìn)行了改進(jìn)，制備了的三種不同結(jié)構(gòu)的納米纖維材料進(jìn)行了比較研究，優(yōu)化了細(xì)胞長(zhǎng)入

2、條件，并探索了不同結(jié)構(gòu)材料促進(jìn)組織再生的可能機(jī)制。
　　本研究中，我們首先制備了納米紗(Aligned Nanoyarn/Nanofibrous Scaffold，AYS)、取向納米纖維支架（Aligned Nanofibrous Scaffold，AFS）和三維多孔納米纖維支架（Three-dimensional porous Nanofibrous Scaffold，3DPS）3種不同結(jié)構(gòu)的納米纖維材料，隨后將大鼠骨髓間充質(zhì)干

3、細(xì)胞(Bone Mesenchymal Stem Cell，BMSC)體外接種至這3種材料中，檢測(cè)BMSC在支架材料中黏附、生長(zhǎng)、增殖和細(xì)胞活性;將AYS、AFS、3DPS材料種植于大鼠皮下，觀察囊壁厚度、異物巨細(xì)胞的形態(tài)數(shù)目，檢測(cè)炎性因子基因表達(dá)水平，評(píng)價(jià)三種材料的生物相容性;比較普通培養(yǎng)方法、間歇離心法以及生物反應(yīng)器動(dòng)態(tài)培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSC的效果，觀察細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和分布情況，優(yōu)化體外培養(yǎng)方法;體外靜態(tài)培養(yǎng)BMSC，觀察細(xì)胞在三種納米

4、纖維支架中的形態(tài)、黏附、增殖、分化等行為，比較纖維環(huán)細(xì)胞相關(guān)表型分子(COL2a1、COL1a1、Aggrecan、Sox-9)mRNA表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)FAK信號(hào)通路相關(guān)蛋白AKT、ERK1/2、JNK、P38表達(dá)水平，評(píng)價(jià)不同結(jié)構(gòu)納米纖維支架促進(jìn)BMSC增殖分化的效果，并初步探索不同結(jié)構(gòu)支架材料促進(jìn)BMSC增殖和誘導(dǎo)分化的機(jī)制。
　　通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)AYS、AFS和3DPS三種納米纖維材料均具有良好的生物相容性;相對(duì)于普通培

5、養(yǎng)法和間歇離心法，生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)法能更好地促進(jìn)大鼠BMSC長(zhǎng)入;不同結(jié)構(gòu)的支架中，BMSC的細(xì)胞黏附、增殖、定向分化行為有顯著差異，AYS材料中，BMSC傾向于分化為成纖維細(xì)胞，3DPS材料中，BMSC傾向于分化為類軟骨細(xì)胞;在不同結(jié)構(gòu)支架中的BMSC的Aggrecan、Sox-9基因表達(dá)量也有顯著差異，F(xiàn)AK信號(hào)通路相關(guān)蛋白AKT、P38表達(dá)水平有顯著差異，提示可能通過Integrin-FAK信號(hào)通路發(fā)揮促進(jìn)增殖和誘導(dǎo)分化的作用。

6、
　　本研究深入研究了AYS、AFS、3DPS三種組織工程支架材料對(duì)BMSC行為的影響，并對(duì)其促進(jìn)細(xì)胞增殖和定向分化的機(jī)制進(jìn)行了初步研究，有助于進(jìn)一步優(yōu)化纖維環(huán)組織工程支架產(chǎn)品，推進(jìn)后續(xù)研究。
　　第一部分 納米紗/多孔納米纖維組織工程支架材料生物相容性研究
　　目的:通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)取向納米紗(AYS)、取向納米纖維支架(AFS)、三維多孔納米纖維支架(3DPS)材料的生物相容性。
　　方法:聚乳酸(PLLA

7、)、聚已內(nèi)酯(PCL)和明膠按不同比例配置通過靜電紡絲技術(shù)制備成取向納米紗(AYS)。聚乳酸(PLLA)和明膠混合采用常規(guī)靜電紡絲技術(shù)制作無規(guī)納米纖維，通過改變接收裝置，制備取向納米纖維支架(AFS)。無規(guī)納米纖維再經(jīng)過勻漿/凍干成型制成三維多孔納米纖維支架(3DPS)。將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)接種于上述支架材料。體外培養(yǎng)后檢測(cè)細(xì)胞在支架材料中黏附、生長(zhǎng)情況、增殖、活性，評(píng)價(jià)體外生物相容性。將三種支架植入大鼠皮下，在不同時(shí)間點(diǎn)

8、取材，通過組織學(xué)染色、免疫組化、測(cè)量囊壁厚度、異物巨細(xì)胞的形態(tài)數(shù)目及炎性因子基因表達(dá)量，評(píng)價(jià)體內(nèi)生物相容性。
　　結(jié)果:體外實(shí)驗(yàn)表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均能在三種材料上黏附、增殖，生長(zhǎng)良好。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明三種材料在體內(nèi)早期（1-2周）均有較輕程度的炎性反應(yīng)，4周后炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，異物巨細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。炎癥因子基因表達(dá)量趨勢(shì)與炎細(xì)胞浸潤(rùn)相符。
　　結(jié)論:體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該支架材料具有良好生物相容性，為進(jìn)一步開發(fā)纖維環(huán)組織工程支架

9、材料應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架材料中長(zhǎng)入條件的優(yōu)化
　　目的:對(duì)比普通培養(yǎng)法、間歇離心法、生物反應(yīng)器動(dòng)態(tài)培養(yǎng)法三種不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長(zhǎng)存活情況，從而優(yōu)化培養(yǎng)方法。
　　方法:將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)接種于取向納米纖維支架(AFS)、取向納米紗(AYS)、三維多孔納米纖維(3DPS)支架材料，分別采用普通培養(yǎng)方法、間歇離心法以及生物反應(yīng)器動(dòng)態(tài)培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)7、14天后，取出支架

10、進(jìn)行如下檢測(cè):HE染色觀察細(xì)胞在支架材料中生長(zhǎng)情況;DAPI檢測(cè)細(xì)胞分布、活性;測(cè)量細(xì)胞長(zhǎng)入深度。
　　結(jié)果:證實(shí)生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)法細(xì)胞能更好地長(zhǎng)入支架材料內(nèi)部，且存活良好。
　　結(jié)論:生物反應(yīng)器灌注培養(yǎng)的動(dòng)態(tài)培養(yǎng)方法更有利于細(xì)胞長(zhǎng)入支架內(nèi)部，且細(xì)胞存活良好。
　　第三部分 不同結(jié)構(gòu)納米纖維支架對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞行為的影響及其機(jī)制研究
　　目的:比較細(xì)胞在不同結(jié)構(gòu)支架材料上的細(xì)胞形態(tài)以及黏附、增殖、分化等行為的

11、差異;比較不同支架內(nèi)纖維環(huán)細(xì)胞相關(guān)表型分子(COL2a1、COL1a1、Aggrecan、Sox-9)mRNA表達(dá)水平以及支架內(nèi)BMSC細(xì)胞中FAK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)差異。明確支架結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞行為的影響，闡明其可能機(jī)制。
　　方法:將前期制備的三種支架材料消毒后備用。在體外將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)接種于三種不同結(jié)構(gòu)支架內(nèi)，靜態(tài)培養(yǎng)3周后比較BMSC在三種纖維支架中細(xì)胞形態(tài)以及黏附、增殖、分化等行為的差異;提取細(xì)胞中cDN

12、A，qRT-PCR測(cè)定關(guān)鍵表型分子（COL2a1、COL1a1、Aggrecan、Sox-9）mRNA表達(dá)水平。通過Western blot對(duì)支架內(nèi)BMSC中相關(guān)蛋白AKT、ERK1/2、JNK、P38含量表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)比不同結(jié)構(gòu)支架對(duì)細(xì)胞行為的影響。
　　結(jié)果:表明不同結(jié)構(gòu)支架對(duì)細(xì)胞黏附、增殖、定向分化等細(xì)胞行為具有明顯影響，在取向性一致且致密結(jié)構(gòu)的支架內(nèi)細(xì)胞形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，且細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ型膠原含量更高，細(xì)胞更易向成纖維細(xì)