鈦材表面納米結(jié)構(gòu)化及其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響.pdf

1、生物材料植入宿主體內(nèi)后，其與生物系統(tǒng)的相互作用（蛋白吸附、細(xì)胞粘附/增殖等）發(fā)生在材料表面。細(xì)胞的生物學(xué)行為主要由材料表面化學(xué)成分和宏觀、介觀與微觀多尺度的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)構(gòu)成的局部微環(huán)境決定。因此，如何構(gòu)建材料表面適宜的細(xì)胞外微環(huán)境，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生理功能，已成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。
　　鈦及鈦合金由于具有良好的物理性能已被作為植入體材料廣泛應(yīng)用于骨科臨床領(lǐng)域。不足之處是，鈦及鈦合金材料表面有生物惰性，缺乏誘導(dǎo)骨生成潛能，導(dǎo)致鈦基植

2、入體與周邊自然骨組織的整合性差，使用壽命短，是其臨床應(yīng)用面臨的普遍挑戰(zhàn)。鑒于此，為了實(shí)現(xiàn)鈦材表面原位調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為，進(jìn)而誘導(dǎo)骨組織形成，亟需研發(fā)新的鈦材表面改性技術(shù)。從模擬類骨納米結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)組分角度出發(fā)，本論文利用機(jī)械研磨技術(shù)、陽(yáng)極氧化等方法制備了表面納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的鈦基材，進(jìn)而沉積磷灰石/明膠，構(gòu)建適宜的細(xì)胞外微環(huán)境，以期提高鈦基植入體的骨整合性。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下：
　　1.表面納米結(jié)構(gòu)化鈦材對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞行為

3、的影響
　　為探究表面納米結(jié)構(gòu)化鈦材對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生理行為的影響，本章利用機(jī)械研磨技術(shù)制備了表面納米結(jié)構(gòu)化鈦材。通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM），透射電鏡（TEM），原子力顯微鏡（AFM），X射線衍射儀（XRD）和接觸角測(cè)試對(duì)表面特性進(jìn)行表征。結(jié)果表明，經(jīng)機(jī)械研磨技術(shù)處理后，在鈦材表面上形成了納米結(jié)構(gòu)化薄層。通過(guò)纖連蛋白（Fn）與牛血清白蛋白（BSA）進(jìn)行蛋白質(zhì)吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，與未處理的純鈦相比，表面納米結(jié)構(gòu)化鈦材對(duì)蛋白吸附量

4、無(wú)顯著的差異性。此外，在細(xì)胞與分子水平上，通過(guò)紐蛋白（vinculin）染色，四唑鹽比色（MTT）檢測(cè)，堿性磷酸酶（ALP）活性檢測(cè)，骨鈣素（OCN）與骨橋蛋白（OPN）染色，茜紅素定量檢測(cè)及骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）、I型膠原蛋白（collagen I）與轉(zhuǎn)錄因子Runx2在mRNA水平表達(dá)等實(shí)驗(yàn)，分別研究了表面納米結(jié)構(gòu)化鈦材對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附、鋪展、增殖及分化的影響。結(jié)果表明，表面納米結(jié)構(gòu)化鈦材促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘

5、附、增殖及骨發(fā)生相關(guān)的蛋白及基因在蛋白質(zhì)與mRNA水平上的表達(dá)。本研究提供了一種制備表面納米結(jié)構(gòu)化鈦材的新方法。
　　2. BMP2功能化TiO2納米管對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞行為的協(xié)同效應(yīng)
　　為探究BMP2功能化TiO2納米管對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞行為的影響，本章利用聚多巴胺中間層將BMP2接枝到不同尺寸直徑（30 nm、60 nm與100 nm）的TiO2納米管上，并利用掃描電子顯微鏡（SEM），X光電子譜（XPS）及接觸角對(duì)材

6、料進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，BMP2已成功地接枝到 TiO2納米管上。此外，進(jìn)一步研究了BMP2修飾的TiO2納米管對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞行為的影響。紐蛋白熒光染色結(jié)果表明，BMP2功能化的TiO2納米管促進(jìn)了細(xì)胞粘附與生長(zhǎng)，且經(jīng)過(guò)7天與14天培養(yǎng)后，在BMP2功能化的TiO2納米管上生長(zhǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)更高的堿性磷酸酶（ALP）活性與礦化量（p<0.05或p<0.01），其中，BMP2功能化的管徑為30 nm的TiO2納米管上生長(zhǎng)的細(xì)胞

7、表現(xiàn)最高。該結(jié)果表明，BMP2功能化的TiO2納米管拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)協(xié)同增效地促進(jìn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與分化。本研究為研發(fā)高骨整合性鈦植入體提供了新方法。
　　3.鈦材表面微環(huán)境的構(gòu)建及其對(duì)體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化與體內(nèi)成骨的影響
　　為模擬自然骨的細(xì)胞外基質(zhì)，本章利用共沉淀方法將磷灰石/明膠沉積在納米結(jié)構(gòu)化鈦材表面，這種納米結(jié)構(gòu)化鈦材是通過(guò)氫氧化鉀與加熱處理后，在表面形成的抗腐蝕納米結(jié)構(gòu)化層。利用紅外（FTIR），場(chǎng)發(fā)射掃

8、描電子顯微鏡（FE-SEM），原子力顯微鏡（AFM）與薄膜 X線衍射（TE-XRD）對(duì)材料進(jìn)行了表征。檢測(cè)結(jié)果表明，磷灰石/明膠成功地沉積在納米結(jié)構(gòu)化鈦材表面。紐蛋白的熒光染色結(jié)果表明，磷灰石/明膠納米成分促進(jìn)了細(xì)胞粘附，更重要的是，在第7，14與21天時(shí)，在磷灰石/明膠納米成分鈦材上生長(zhǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)了更高的增殖與堿性磷酸酶（ALP）活性。并且，骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）和I型膠原蛋白（p<0.05或p<0.01）的