金屬純鈦表面梯度納米結(jié)構(gòu)化及其對人羊膜間充質(zhì)干細胞黏附、增殖與分化的影響.pdf

1、目的:在醫(yī)用金屬純鈦表面進行梯度納米結(jié)構(gòu)化，評價梯度納米純鈦材料對人羊膜間充質(zhì)干細胞(hAMSCs)黏附、增殖和分化的影響，為新型種植材料的開發(fā)提供實驗依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.材料制備:采用表面機械研磨處理(SMAT)技術(shù)，在醫(yī)用金屬純鈦板材料表面進行梯度納米結(jié)構(gòu)化，并獲得表面晶粒尺寸為納米級的金屬純鈦材料。SMAT處理后再經(jīng)退火處理，使晶粒長大，獲得表面粗糙度相同的粗晶金屬純鈦材料。
　　2.采用透射電子顯微

2、鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)和表面粗糙度儀對實驗材料進行表征。計算其表面晶粒尺寸范圍，確定表面晶粒的平均尺寸和表面粗糙度。
　　3.經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會同意和患者知情同意，在無菌操作下提取人羊膜間充質(zhì)干細胞(hAMSCs)，利用流式細胞術(shù)對hAMSCs表面的CD29、CD44、CD73進行鑒定。采用堿性磷酸酶(ALP)染色法和茜素紅染色法對hAMSCs成骨向分化行為進行觀察。
　　4.采用Cell

3、Counting Kits-8(CCK-8)法檢測hAMSCs的增殖情況并繪制hAMSCs的增殖曲線。
　　5.分組:實驗組為納米級金屬純鈦材料(nano-Ti)，對照組為粗晶金屬純鈦材料(coarse-Ti)。分別在各組材料表面進行hAMSCs的接種與培養(yǎng)。
　　6.采用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察hAMSCs在各組材料表面的黏附及生長狀況。
　　7.利用免疫熒光對肌動蛋白（細胞骨架）、紐蛋白（黏著蛋白）和細胞核進行

4、染色觀察細胞形態(tài)。
　　8.采用MTS法和流式細胞儀(FCM)檢測法分析hAMSCs在各組材料表面的增殖情況。
　　9.采用堿性磷酸酶(ALP)活性和骨鈣素(OCN)蛋白表達水平上的含量測定技術(shù)分析各組材料對hAMSCs成骨向分化的影響。
　　結(jié)果:1.TEM結(jié)果:通過SMAT方法可以對金屬鈦板表面進行納米結(jié)構(gòu)化并獲得梯度納米結(jié)構(gòu)，其表面晶粒尺寸多分布在10-100nm范圍內(nèi)，平均晶粒尺寸約為56nm。
　　2.

5、hAMSCs的培養(yǎng)與鑒定:光學(xué)顯微鏡下見hAMSCs原代培養(yǎng)3d后，大部分細胞為梭形或多角形，培養(yǎng)6d后細胞融合度達80％以上，呈放射狀或漩渦狀排列。hAMSCS經(jīng)成骨誘導(dǎo)14d后，ALP染色見細胞胞質(zhì)呈棕黑色;成骨誘導(dǎo)21d后，茜素紅染色見細胞之間有明顯深染的紅色鈣結(jié)節(jié)形成，這些說明hAMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液定向誘導(dǎo)后可以分化為成骨細胞。利用流式細胞儀對hAMSCs的表面抗原CD29、CD44、CD73進行檢測，陽性率都為90％以上

6、。
　　3.CCK-8法繪制hAMSCs的增殖曲線:hAMSCs傳代培養(yǎng)后的潛伏期為2天，對數(shù)增殖期為第3到第6天，隨后進入平臺期。
　　4.SEM觀察結(jié)果:hAMSCs接種在各組材料表面2d后，在納米金屬純鈦上的細胞伸展較粗晶純鈦上的好，可見大量的絲狀偽足。說明與粗晶純鈦相比，納米金屬純鈦材料具有良好的促進hAMSCs伸展和黏附的能力。
　　5.免疫熒光染色結(jié)果:hAMSCs接種在各組材料表面2天后，與粗晶純鈦相比，

7、納米純鈦上的細胞伸展良好，在細胞邊緣可見大量的紐蛋白形成。說明納米金屬純鈦材料具有良好的促進hAMSCs黏附的能力
　　6.MTS檢測結(jié)果:隨著培養(yǎng)時間的延長，各組材料上hAMSCs的MTS值均而逐漸升高。且在各個時間點，納米組MTS值均高于粗晶組。在培養(yǎng)的第3d、5d和7d時，各組間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明納米金屬純鈦材料比粗晶金屬純鈦材料具有更好的促進hAMSCs增殖的能力。
　　7.FCM檢測結(jié)果:培養(yǎng)5d時，納米

8、組細胞的增殖指數(shù)(PI)高于粗晶組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明納米金屬純鈦材料相對于粗晶金屬純鈦材料具有更好的促進hAMSCs增殖的能力。
　　8.ALP活性檢測結(jié)果:隨時間的增加，各組材料上細胞的ALP活性均逐漸升高。在各個時間點，納米組ALP活性高于粗晶組。在第3d、7d、14d納米組與粗晶組的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，這說明納米金屬純鈦材料相對于粗晶金屬純鈦材料具有更好的促進早期hAMSCs成骨向分化的能力。
　　9.OC

9、N蛋白表達水平上的含量檢測結(jié)果:隨著時間的延長，各組材料上細胞的OCN蛋白表達水平上的含量均而逐漸升高。在各個時間點，納米組的OCN蛋白表達水平上的含量均高于粗晶組，且在培養(yǎng)10d和14d時，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明梯度納米金屬純鈦材料相對于粗晶金屬純鈦材料具有更好的促進hAMSCs成骨向分化的能力。
　　結(jié)論:1.采用SMAT方法可以獲得梯度納米金屬純鈦材料，其表面晶粒范圍為10-100nm，平均晶粒尺寸為56nm。