低氧促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化及其機(jī)制研究.pdf

1、氧是維持生命的必要條件，也是細(xì)胞功能的一種重要生理調(diào)節(jié)因子，而低氧是生命發(fā)育的基本環(huán)境。例如，在妊娠的早期，由于沒(méi)有血管的形成，所以胚胎是在低氧環(huán)境中發(fā)育的。低氧作為一種生理性的刺激因素，影響著胚胎的發(fā)生、發(fā)育及正常功能的維持。低氧可激活低氧誘導(dǎo)因子(HIF)，從而調(diào)控一系列與低氧相關(guān)基因的表達(dá)。例如，誘導(dǎo)與葡萄糖分解、轉(zhuǎn)運(yùn)、紅細(xì)胞和血管再生等相關(guān)的基因，使其表達(dá)增加，從而維持體內(nèi)氧環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。關(guān)于低氧作用的研究，目前多集中在低氧對(duì)細(xì)胞

2、的損傷和有關(guān)的適應(yīng)機(jī)制方面，而對(duì)低氧在細(xì)胞增殖、分化中影響的研究較少。特別是對(duì)于體內(nèi)胚胎發(fā)生時(shí)期和成年后的一些生理、病理過(guò)程中，出現(xiàn)細(xì)胞局部微環(huán)境低氧的情況重視不足。干細(xì)胞包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外培養(yǎng)和增殖分化作用的研究都是在常氧(20％O2)條件下進(jìn)行的，這樣難以反映體內(nèi)的真實(shí)情況。低氧在體內(nèi)作為一種生理性的刺激因素，對(duì)體外培養(yǎng)的MSCs增殖和分化的作用目前還不清楚，也沒(méi)有引起科研人員的足夠重視。而人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hM

3、SCs)是目前臨床應(yīng)用前景最好的成體干細(xì)胞，因此，本文就低氧對(duì)hMSCs體外增殖和分化作用進(jìn)行了初步研究。 1.低氧對(duì)hMSCs體外增殖的作用探討不同方式低氧對(duì)hMSCs體外增殖的影響。實(shí)驗(yàn)采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞術(shù)分別觀察了間歇性低氧(3％O2、10％O2)和持續(xù)性低氧(3％O2、10％O2、100μmol/LCoCl2、200μmol/LCoCl2)對(duì)hMSCs數(shù)量以及增殖指數(shù)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，間歇性低氧對(duì)hMSCs數(shù)

4、量和增殖指數(shù)無(wú)明顯影響；持續(xù)性低氧各組hMSCs數(shù)量和增殖指數(shù)均增加(P＜0.05)。提示持續(xù)性低氧可促進(jìn)體外培養(yǎng)的hMSCs增殖，說(shuō)明持續(xù)性低氧作為體外的一種可控制因素，可調(diào)節(jié)hMSCs的體外增殖，對(duì)于hMSCs的臨床應(yīng)用具有一定的意義。 同時(shí)本研究還應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析了低氧對(duì)hMSCs增殖過(guò)程中基因表達(dá)譜的變化。結(jié)果顯示21329個(gè)基因中282個(gè)基因有差異性表達(dá)。從基因?qū)W的角度證實(shí)了低氧對(duì)hMSCs增殖的影響是一個(gè)多基因參

5、與的復(fù)雜過(guò)程。并從基因芯片的結(jié)果中篩選出5個(gè)目的基因，用RT-PCR方法檢測(cè)了這5個(gè)基因的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)在常氧環(huán)境中培養(yǎng)的hMSCs有HIF-1αmRNA的表達(dá)，hMSCs在持續(xù)性低氧3d內(nèi)其HIF-1αmRNA的表達(dá)均無(wú)明顯變化。提示持續(xù)性低氧促進(jìn)hMSCs的增殖可能是通過(guò)非HIF-1通路的作用。 2.低氧對(duì)hMSCs體外誘導(dǎo)分化的作用2.1β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol，BME)誘導(dǎo)hMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞

6、方向分化的方法建立常規(guī)培養(yǎng)的hMSCs，以2×105/皿密度接種于涂有纖維結(jié)合素的35mm培養(yǎng)皿中，隨機(jī)分成兩組：對(duì)照組和分化組。分化組于接種24h后更換培養(yǎng)液，加入預(yù)誘導(dǎo)液預(yù)誘導(dǎo)24h；之后更換培養(yǎng)液，再加入誘導(dǎo)液誘導(dǎo)5h。結(jié)果顯示：hMSCs經(jīng)BME的誘導(dǎo)可向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向分化，并且，此方法穩(wěn)定可靠。 2.2低氧對(duì)BME誘導(dǎo)hMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞方向分化的影響實(shí)驗(yàn)分三組：對(duì)照組、常氧分化組和低氧分化組。后兩組誘導(dǎo)方法同上

7、，低氧分化組是在3％O2的環(huán)境下進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)和誘導(dǎo)。鏡下觀察低氧分化組hMSCs轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣形態(tài)的明顯多于常氧分化組；免疫組化顯示，低氧分化組TH染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(24.8±1.2)％，明顯高于常氧分化組(8.6±0.3)％，統(tǒng)計(jì)有顯著性差異(P＜0.001)。 2.3低氧對(duì)BME誘導(dǎo)hMSCs分化的細(xì)胞多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量的影響應(yīng)用HPLC測(cè)定細(xì)胞內(nèi)外DA和HVA的含量。檢測(cè)出常氧分化組和低氧分化組DA遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物HVA

8、，對(duì)照組則未被檢測(cè)出DA和HVA。常氧分化組和低氧分化組細(xì)胞內(nèi)DA含量均高于細(xì)胞外(前者P＜0.05，后者P＜0.01)，而HVA則細(xì)胞外均高于細(xì)胞內(nèi)(二者P＜0.001)。低氧分化組DA總含量和HVA總含量均增高，與常氧分化組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(前者P＜0.01，后者P＜0.05)。以上結(jié)果提示，低氧可促進(jìn)hMSCs向多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的方向分化。 2.4低氧對(duì)誘導(dǎo)前后HIF-1α、THmRNA和HIF-1α蛋白表達(dá)的影響在預(yù)誘

9、導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)4h、8h、12h、24h和誘導(dǎo)2h、5h時(shí)同時(shí)提取三組細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示，在常氧環(huán)境下培養(yǎng)的hMSCs即有HIF-1αmRNA表達(dá)，常氧分化組和低氧分化組不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1αmRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化；對(duì)照組細(xì)胞不表達(dá)THmRNA，常氧分化組預(yù)誘導(dǎo)8h時(shí)有THmRNA表達(dá)，到誘導(dǎo)2h時(shí)THmRNA表達(dá)的灰度明顯升高。低氧分化組預(yù)誘導(dǎo)4h時(shí)即有THmRNA表達(dá)，之后THmRNA表達(dá)的灰度無(wú)明顯變化。

10、 在預(yù)誘導(dǎo)24h和誘導(dǎo)2h、5h時(shí)同時(shí)收集三組細(xì)胞，提取細(xì)胞總?cè)芙獾鞍?，以?actin作為內(nèi)參，進(jìn)行Western蛋白免疫雜交。結(jié)果顯示，對(duì)照組無(wú)HIF-1α蛋白表達(dá)，常氧分化組預(yù)誘導(dǎo)24h時(shí)有HIF-1α蛋白表達(dá)，低氧分化組預(yù)誘導(dǎo)24h時(shí)HIF-1α蛋白表達(dá)量高于常氧分化組，誘導(dǎo)2h、5h時(shí)兩個(gè)分化組細(xì)胞不表達(dá)HIF-1α蛋白。以上結(jié)果提示，低氧促進(jìn)hMSCs向多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的方向分化可能是通過(guò)HIF-1的通路實(shí)現(xiàn)的。