hHGF促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、我國有9300萬的乙型肝炎病毒攜帶者，其中2 千萬人為乙肝患者，酒精性肝病及非酒精性肝病的發(fā)病率亦逐年升高，眾多慢性肝臟損傷因素導(dǎo)致纖維結(jié)締組織異常增生，引起肝功能失代償、肝腹水、肝癌、上消化道出血等一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，藥物難以醫(yī)治，肝移植是目前治療終末期肝病最為有效的方法，但困于肝源缺乏等問題，極大的限制了其臨床應(yīng)用，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞因其無限增殖及多向分化的潛能，有望成為治療終末期肝病的又一可行方法，并已成為研究熱點(diǎn)。
　　 源

2、于中胚層的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有極強(qiáng)的可塑造性，多項(xiàng)研究表明，其可分化為三個(gè)胚層的細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞等。在急慢性肝病中，移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行臨床治療已經(jīng)在多篇文獻(xiàn)中報(bào)道，且有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)已在動(dòng)物體內(nèi)或體外誘導(dǎo)過程中加入各種生長因子，以達(dá)到提高干細(xì)胞移植療效的目的，目前尚缺乏轉(zhuǎn)染基因后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)成肝樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 有研究表明肝細(xì)胞生長因子（HGF）為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝

3、細(xì)胞分化最重要的始動(dòng)因子之一[8]，HGF作用的發(fā)揮同細(xì)胞膜受體c-met的結(jié)合密不可分。HGF蛋白與其受體c-Met 結(jié)合后導(dǎo)致c-Met β鏈的酪氨酸 Tyr-1234及 Tyr-1235 殘基自身磷酸化，由此激活了受體內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞分裂或分化增加、運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)、細(xì)胞間連接消失，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用[19]。
　　 目的：
　　 本研究應(yīng)用貼壁培養(yǎng)法，培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將HGF基

4、因轉(zhuǎn)染入人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過G418 篩選出轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞群后擴(kuò)增出轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞克隆，分別應(yīng)用激光共聚焦、RT-PCR、Western Blot對比轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中HGF的表達(dá)，此后，運(yùn)用酒精性肝硬化病人血清對轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，7D及14D后分別檢測轉(zhuǎn)染前后的各個(gè)細(xì)胞組中AFP、ALB表達(dá)水平，探討轉(zhuǎn)染人促肝細(xì)胞生長因子（hHGF）對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）向肝樣細(xì)胞分化的影響。
　　 方法：
　　

5、 1．克隆hHGF基因，構(gòu)建攜帶hHGF基因的真核表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1(+)-hHGF），首先應(yīng)用PCR法獲得HGF cDNA，再次應(yīng)用限制性內(nèi)切酶將HGF cDNA及pcDNA3.1(+)切成粘性末端，T4 連接酶連接，構(gòu)建重組載體。
　　 2．貼壁培養(yǎng)法擴(kuò)增人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，每日倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況，隔日換液，獲得了一些貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的體會(huì)與經(jīng)驗(yàn)，擴(kuò)增后選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。
　　 3．用

6、脂質(zhì)體將pcDNA3.1(+)-hHGF 轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，G418 篩選轉(zhuǎn)染后的陽性克隆，分別通過激光共聚焦、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、免疫蛋白印跡(Western blot）檢測hBMSCs中表達(dá)hHGF的水平；
　　 4．用酒精性肝硬化患者血清誘導(dǎo)hBMSCs，采用Western blot分別檢測各組細(xì)胞內(nèi)甲胎蛋白（AFP）及白蛋白（ALB）的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1．瓊脂糖電泳提

7、示，擴(kuò)增的目的基因hHGF的cDNA為2200bp，成功將此cDNA與帶有粘性末端的質(zhì)粒定向連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及測序鑒定，hHGF基因讀碼框架完全正確；
　　 2．細(xì)胞培養(yǎng)傳代成功，細(xì)胞生長良好，呈梭形及魚群樣生長，獲取較多生長狀態(tài)良好的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；
　　 3．通過脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒成功的導(dǎo)入了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)過G418 篩選，激光共聚焦、RT-PCR、Western blot 結(jié)果均證實(shí)經(jīng)轉(zhuǎn)染h

8、HGF基因后的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中hHGF分子呈高表達(dá)；
　　 4．人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)后逐漸變?yōu)樯掀ぜ?xì)胞樣細(xì)胞，形態(tài)呈三角形或不規(guī)則形，未經(jīng)誘導(dǎo)組細(xì)胞變化不明顯，Western blot 結(jié)果表明誘導(dǎo)7D，14D 轉(zhuǎn)染hHGF基因后的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中AFP、ALB表達(dá)明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組。
　　 結(jié)論：
　　 1．?dāng)U增了hHGF cDNA 全長序列，且成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-hHGF；<

9、br>　　 2．貼壁培養(yǎng)法可培養(yǎng)出人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并在體外進(jìn)行大量擴(kuò)增，細(xì)胞狀態(tài)良好；
　　 3．重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-hHGF 可通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，hHGF基因在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)可以成功表達(dá)目的蛋白；
　　 4．人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)酒精性肝硬化血清誘導(dǎo)后可向肝樣細(xì)胞分化，hHGF基因轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的能力增高，表明hHGF基因在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)后可以提高人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的能力。