電磁場促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化及初步機制.pdf

1、目的：（1）體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，并鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞。（2）通過檢測電磁場對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化指標的影響，研究電磁場促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨分化的效應。（3）研究電磁場對骨髓間充質(zhì)干細胞向成脂肪分化影響。（4）研究電磁場對骨髓間充質(zhì)干細胞信號通路的影響，并探討電磁場激活的信號通路同電磁場促成骨效應間的聯(lián)系。
　　 方 法：用梯度離心+反復貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)和純化骨髓間充質(zhì)干細胞，取純度較高且活性良好的P4-P6代細胞

2、作為我們研究的靶細胞。
　　 （1）采用多向分化誘導和流式細胞檢測骨髓間充質(zhì)干細胞表面標志物等方法對所取骨髓間充質(zhì)干細胞進行鑒定，以確定所取細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　 （2）通過PNPP法檢測堿性磷酸酶活性，RT-PCR和實時定量PCR檢測骨髓間充質(zhì)干細胞多種成骨指標：ALP、RUNX2、BMP2、BSP、DLX5的表達，免疫組化檢測I型膠原的表達，Von Kossa染色法檢測鈣結節(jié)的形成等方法探討電磁場促進骨髓間充

3、質(zhì)干細胞成骨分化的效應。
　　 （3）通過RT-PCR和實時定量PCR檢測成脂肪指標的表達、western blot 檢測PPARγ蛋白的表達，油紅O染色檢測脂肪滴的形成，檢測電磁場對骨髓間充質(zhì)干細胞成脂肪分化的影響。
　　 （4）通過Western Blot、ELISA等方法檢測電磁場對MAPK、AKT、cAMP-PKA等信號通路的影響，找出相關激活的信號通路及作用位點。
　　 （5）通過加入信號通路抑制劑或激

4、動劑，檢測在抑制或活化信號通路的條件下電磁場促成骨效應的變化，探討電磁場激活的信號通路同其促成骨效應間的聯(lián)系。
　　 結 果：（1）所取細胞在倒置顯微鏡下觀察呈成梭形或多角形，有較好的折光性；生長迅速，常成簇狀，集落狀生長。在成骨誘導培養(yǎng)基作用下21天后可形成大量鈣結節(jié)，在成脂肪誘導培養(yǎng)基作用下14天后有大量脂肪滴的形成。流式鑒定結果顯示，CD90+，CD45-；CD29+, CD45-的表達率均在95％以上，而CD45+陽性的

5、表達率小于5％，這表明其基本不含造血細胞系，細胞均一性良好，符合骨髓間充質(zhì)干細胞表面標記物特征。
　　 （2）電磁場作用三天后明顯促進堿性磷酸酶活性的表達，促進I型膠原的表達，多種成骨指標：ALP、BMP2、DLX5、BSP、RUNX2等mRNA的表達在電磁場作用三天后表達明顯升高。在成骨誘導培養(yǎng)基的作用下，15天和21天鈣結節(jié)染色電磁場作用組較對照組鈣結節(jié)數(shù)目明顯增多。
　　 （3）RT-PCR及實時定向PCR顯示電磁

6、場作用下，成脂肪分化指標PPAR-γ2、adipsin、AP2等mRNA下調(diào)；PPAR-γ2蛋白表達下調(diào)；脂肪滴的形成減少。
　　 （4）電磁場作用細胞15min、30min、60min、120min后檢測cAMP、PKA、ERK1/2、P38、JNK、AKT等信號通路位點，結果顯示電磁場增加cAMP和PKA的表達；促進磷酸化ERK1/2和P38的表達；而對JNK和AKT等磷酸化表達沒有影響。加入PKA抑制劑H-89及ERK1/

7、2抑制劑PD98059后，檢測電磁場促成骨指標表達變化，顯示加入通路抑制劑抑制電磁場激活的信號通路將明顯抑制電磁場的促成骨效應。
　　 結 論：
　　 （1）通過梯度離心法+反復貼壁分離法可獲得純度較高的骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　 （2）電磁場可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨分化。
　　 （3）電磁場抑制骨髓間充質(zhì)干細胞向成脂肪細胞分化。
　　 （4）電磁場激活骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)cAMP-PKA信號通