不同頻率脈沖電磁場促人骨髓間充質(zhì)干細胞增殖分化的實驗研究.pdf

1、目的：細胞是組織構建的基礎，目前種子細胞的體外擴增需要3周左右時間，體外構建組織工程骨要想滿足臨床需要，如何使種子細胞大量，快速，優(yōu)質(zhì)擴增是面臨的首要問題。本實驗室前期工作證明，特定參數(shù)的脈沖電磁場(pulsedelectromagneticfields，PEMFs)能夠?qū)θ斯撬栝g充質(zhì)干細胞(humanmesenchymalstemcells，hMSCs)的增殖產(chǎn)生促進作用，并誘導成骨。然而刺激的頻率不同，是否會對細胞增殖及分化產(chǎn)生不同

2、的影響?在組織工程骨的體外構建中我們應該選擇怎樣的合適頻率范圍?細胞是以群體而不是以孤立的形式生長，細胞間存在物質(zhì)和信息交換，脈沖電磁場是否會對縫隙連接細胞間通訊(Gapjunctionalintercellularcom-munication，GJIC)功能產(chǎn)生影響，進而影響細胞增殖分化?這些問題尚缺乏系統(tǒng)的研究。本研究旨在探討不同頻率段PEMFs刺激對hMSCs體外增殖分化的作用，以期找出適合的頻率范圍，為應用PEMFs促進hMSC

3、s快速大量優(yōu)質(zhì)擴增，誘導成骨分化，研制新型生物反應器，以及進一步研究PEMFs刺激對MSCs生物學效應的機制提供實驗依據(jù)。 方法：1、頻率分組：選擇1-150Hz頻率范圍，將體外培養(yǎng)的第三代hMSCs分為5、25、50、75、100、150HzPEMF刺激組和不施加PEMF的對照組。2、參數(shù)選擇：脈沖電磁場刺激強度1.1mT，時間30min/d，持續(xù)作用21天。3、倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。4、四氮噻唑鹽(MTT)比色法檢測h

4、MSCs的增殖，繪制細胞生長曲線。5、流式細胞儀檢測hMSCs細胞周期。6、酶化學法測定細胞堿性磷酸酶(ALP)活性。7、放免法測定細胞骨鈣素的分泌情況。9、茜素紅鈣染色檢測鈣結(jié)節(jié)的形成。9、透射電鏡觀察hMSCs超微結(jié)構，觀察細胞間縫隙連接。10、采用熒光光漂白恢復(Fluorescenceredistributionafterphotobleaching，F(xiàn)RAP)技術，通過激光共聚焦顯微鏡檢測hMSCs經(jīng)PEMF刺激后的縫隙連接功

5、能(GJIC)變化。 結(jié)果：1、經(jīng)PEMF刺激的hMSCs，3d后密度較對照組增高，體積逐漸增大，形態(tài)變?yōu)槿切巍⒍嘟切?、鱗形，胞漿中含有較多的基質(zhì)成分和顆粒狀物質(zhì)。不同頻率的PEMF作用組間細胞形態(tài)無明顯差別。隨培養(yǎng)時間延長，細胞逐漸匯合呈鋪路石狀，進而出現(xiàn)重疊生長，基質(zhì)堆積，3周后基質(zhì)礦鹽沉積并融合成圓形或卵圓形的鈣化結(jié)節(jié)。2、MTT檢測顯示經(jīng)PEMFs刺激后的hMSCs增殖能力明顯比對照組強，實驗組較對照組生長曲線前移，并

6、且峰值增高。其中50Hz刺激組生長曲線最高，明顯快于其他頻率刺激組(P＜0.05)。3、流式細胞儀檢測表明，經(jīng)PEMFs作用以后，所有樣本均未發(fā)現(xiàn)有DNA倍體異常的細胞(diploid：100％)；hMSCs細胞周期發(fā)生了改變，S期細胞百分比增高。刺激頻率不同，細胞周期改變不一，其中以50Hz頻段效果最為明顯，S期細胞百分比(28.09±0.25)％較對照組(13.57±0.15)％增高107％，也明顯高于其他頻率刺激組(P＜0.05)

7、。4、ALP活性檢測的前6d，除5Hz組外各頻率組hMSCs的ALP水平比對照組有增高，但組間無明顯差異；隨著刺激時間延長，各PEMF刺激組ALP活性增強更為明顯，12d基本達到高峰；15d時變化不大，基本到達穩(wěn)定值，各刺激組均遠遠高于對照組水平(P＜0.05)。其中50Hz刺激組明顯高于其它頻率刺激組(P＜0.05)。5、骨鈣素定量檢測，第1周，對照組骨鈣素測不出，各刺激組間無顯著性差異(P＞0.05)；.第2周，對照組骨鈣素測不出，

8、各刺激組間有顯著性差異(P＜0.05)；第3周，各刺激組間和對照組間以及各刺激組間有顯著性差異，其中50Hz組骨鈣素含量最高(P＜0.05)。6、透射電鏡下觀察到經(jīng)PEMF刺激的hMSCs核質(zhì)比例較小，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的細胞器，如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等；相鄰細胞間可以看見一些細胞膜局部電子密度增高的縫隙連接結(jié)構。7、熒光光漂白恢復法(FRAP)測定PEMF刺激組和對照組細胞GJIC功能，F(xiàn)EMF刺激組細胞平均熒光恢復率為(64.12

9、±0.83)％，對照組細胞平均熒光恢復率為(35.26±0.76)％，二者比較有顯著性差異(P＜0.05)，表明經(jīng)PEMF刺激的hMSCs縫隙連接通訊功能明顯提高。 結(jié)論：頻率是影響脈沖電磁場促人間充質(zhì)干細胞增殖分化的重要因素之一。脈沖電磁場刺激頻率不同，對間充質(zhì)干細胞的促增殖分化作用不一，50Hz可能是促進hMSCs體外增殖分化的適合頻率。PEMFs對hMSCs的細胞間縫隙連接通訊(GJIC)功能有顯著促進作用，而GJIC功能