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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
比較芹菜素及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物(如白楊素、香葉木素、黃芩苷元、槲皮素)的成骨效應(yīng),以促進(jìn)骨組織工程構(gòu)建并用于臨床。此外,也為骨折創(chuàng)傷愈合、骨質(zhì)疏松癥相關(guān)治療的新藥開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。
方法:
實(shí)驗(yàn)于2013年~2015年在暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心細(xì)胞房和暨南大學(xué)骨科疾病研究所完成。從廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買(mǎi)雄性、4周齡SD大鼠。首先,通過(guò)全骨髓法提取骨髓原代細(xì)胞,并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),并利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測(cè)定
2、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和流式細(xì)胞表面標(biāo)記流式分析。其次,將第3代的MSCs分為以下4組:(1)空白對(duì)照組(陰性對(duì)照組,含10%FBS的L-DMEM)(2)經(jīng)典成骨誘導(dǎo)組(10%FBS+L-DMEM+50μg/ml維生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉+10-8mol/L地塞米松)(3)芹菜素組(10%FBS+L-DMEM+20μM的芹菜素)(4)芹菜素結(jié)構(gòu)類(lèi)似物(10%FBS+L-DMEM+20μM白楊素)。測(cè)定的指標(biāo)包括:(1)茜素紅染色檢測(cè)
3、,確定細(xì)胞外基質(zhì)的礦物化;(2)各組細(xì)胞分別作用7d及14d后,Real-time PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因;(3)誘導(dǎo)7d以及14d之后,Western Blot檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白。對(duì)相關(guān)指標(biāo)方差分析比較組間差異,以P<0.05為差異有顯著性意義,P<0.01為差異有非常顯著性意義。
結(jié)果:
1.經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)探索,7天、14天后細(xì)胞完全貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞形態(tài)均一,呈梭形生長(zhǎng),細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛,可穩(wěn)定連續(xù)傳代,細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)速度
4、未見(jiàn)明顯變化。
2.BMSCs在接種第一天為細(xì)胞潛伏適應(yīng)期,第二天到第三天生長(zhǎng)曲線基本為線性曲線,表明這段時(shí)間是細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。第四天生長(zhǎng)曲線變得平緩,第五天又急速生長(zhǎng),第六天后曲線逐漸變得平緩,細(xì)胞增殖明顯減慢甚至出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)的趨勢(shì),生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期。
3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,培養(yǎng)的第3代大鼠 BMSCs均一表達(dá)CD29,CD44,CD90,陽(yáng)性率分別為95.65%,87.09%,93.51%;而CD34,CD4
5、5呈陰性,陽(yáng)性率分別為0.96%,1.19%。
4.茜素紅染色結(jié)果顯示,芹菜素和經(jīng)典成骨分別誘導(dǎo)大鼠BMSCs7d,14d后,細(xì)胞聚集樣生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞外鈣鹽沉積,在聚集生長(zhǎng)的中心可見(jiàn)點(diǎn)狀染色陽(yáng)性的鈣化結(jié)節(jié);其中,經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液組鈣化結(jié)節(jié)形成的作用更強(qiáng),形成的鈣化結(jié)節(jié)不但數(shù)量多,且面積(團(tuán)塊狀)也較前兩者大。
5. RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因CollagenⅠ,ALP,Runx2 and OPN mRNA的表達(dá),總體
6、來(lái)講,研究與前面相吻合。即芹菜素能促進(jìn)CollagenⅠ,ALP,Runx2 and OPN mRNA的表達(dá)。
6.Western blot檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白CollagenⅠ,ALP,Runx2和OPN mRNA的表達(dá)。經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液、芹菜素、白楊素均能增加成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)。導(dǎo)其中經(jīng)白楊素組誘導(dǎo)的細(xì)胞CollagenⅠ蛋白、OPN蛋白表達(dá)最高,芹菜素次之。經(jīng)成骨誘導(dǎo)劑組誘導(dǎo)的細(xì)胞ALP、RUNX2蛋白表達(dá)水平最高,芹菜素與白
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