張應(yīng)力誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)是一類具有向中胚層、外胚層及內(nèi)胚層多種組織細(xì)胞分化能力的原始細(xì)胞；在體外、體內(nèi)均可定向分化為成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞；作為這些骨生成細(xì)胞的來(lái)源細(xì)胞，MSCs是骨組織再生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)?；谄涠嘞蚍只瘽撃?，骨髓MSCs目前己成為組織工程、細(xì)胞工程領(lǐng)域最重要的種子細(xì)胞，其潛在應(yīng)用價(jià)值越來(lái)越受到人們重視；有關(guān)骨髓MSCs的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究逐漸成為國(guó)際上干細(xì)胞領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。

2、 骨組織的再生和改建涉及復(fù)雜的力學(xué)刺激，其中機(jī)械力學(xué)刺激是其中非常重要的一環(huán)；尤其在牽張成骨(distractionosteogenesis，DO)的骨再生過(guò)程中，適宜的機(jī)械張應(yīng)力刺激則顯得尤為重要。在牽張成骨中，新骨形成涉及多種細(xì)胞參與，這包括未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)、成骨細(xì)胞(OB)及其前體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、破骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等；其中MSCs在機(jī)械張應(yīng)力下向牽張區(qū)募集、增殖、及成骨細(xì)胞向分化，是新骨形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。機(jī)械

3、力學(xué)刺激是細(xì)胞在生物進(jìn)化過(guò)程中受到的最基本的生物刺激之一。適當(dāng)?shù)臋C(jī)械力學(xué)刺激可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和功能的維持，但過(guò)度或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的力學(xué)刺激又會(huì)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能造成損害；因此細(xì)胞是如何感受力學(xué)刺激信號(hào)并將其轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號(hào)的，其中涉及哪些信號(hào)通路以及相關(guān)基因的表達(dá)，一直是各國(guó)學(xué)者不斷探索的前沿課題。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在成骨細(xì)胞對(duì)張應(yīng)力的反應(yīng)及相關(guān)基因表達(dá)方面進(jìn)行了初步的研究，并獲得了可喜的初步成果；然而，牽張成骨中機(jī)械張應(yīng)力是如

4、何誘導(dǎo)MSCs向牽張區(qū)募集、增殖、及成骨細(xì)胞向分化，這一過(guò)程涉及哪些基因的表達(dá)調(diào)控，以及張應(yīng)力對(duì)MSCs的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生何種影響，這一系列問題的研究在國(guó)際上尚屬空白。 基于上述研究背景，本研究擬對(duì)機(jī)械張應(yīng)力下骨髓MSCs細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能變化、以及成骨相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行初步的研究探討，以期為MSCs在DO、正畸矯治中作用的分子機(jī)制研究提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究首先通過(guò)密度梯度離心法和貼壁法兩種分離方法

5、分離培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs；并對(duì)兩種方法所獲MSCs的細(xì)胞純度、增殖活力及成骨特性進(jìn)行比較；以建立一種較為理想的MSCs體外分離、培養(yǎng)體系。進(jìn)而，對(duì)所獲骨髓MSCs進(jìn)行骨向、肌向、神經(jīng)向多向分化誘導(dǎo)，以期進(jìn)一步探索骨髓MSCs的體外生物學(xué)特點(diǎn)，證實(shí)其多向分化能力，為其在骨組織工程、基因工程以及其他組織器官的修復(fù)和再造中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在上述前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)采用四點(diǎn)彎曲細(xì)胞力學(xué)加載裝置，對(duì)MSCs施加不同大小的機(jī)械力學(xué)刺激，并

6、通過(guò)SyberGreenReal-timeRT-PCR的方法對(duì)成骨相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討了這些基因在MSCs中的表達(dá)規(guī)律。為了模擬臨床牽張成骨中牽張器的單次加力狀態(tài)，對(duì)MSCs進(jìn)一步施加單一周期性張應(yīng)力(2000μstrain，40min)，并對(duì)上述成骨基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，以期為單次加力后細(xì)胞基因表達(dá)規(guī)律的研究及臨床牽張頻率的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)，對(duì)MSCs和OB施加4000μstrain的機(jī)械超負(fù)荷，利用熒光標(biāo)

7、記技術(shù)，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，進(jìn)一步探討了MSCs和OB對(duì)過(guò)大機(jī)械力學(xué)刺激的細(xì)胞反應(yīng)及骨架蛋白F-actin的變化；并采用TUNEL技術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行了檢測(cè)，以更全面地了解MSCs的力學(xué)應(yīng)答過(guò)程，為力學(xué)刺激下骨組織細(xì)胞信號(hào)應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)的進(jìn)一步研究，以及臨床頜骨牽張、正畸矯治中選擇最適力提供理論依據(jù)。 結(jié)果顯示：1.本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了大鼠骨髓MSCs體外培養(yǎng)技術(shù)，并說(shuō)明了密度梯度離心法是目前分離純化骨髓MSCs較好的方法。

8、 2.骨髓MSCs在體外誘導(dǎo)劑作用下可成功地分化為成骨樣細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞和成肌細(xì)胞，說(shuō)明所獲細(xì)胞具有體外多向分化能力；免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)表明，所獲細(xì)胞呈SH3陽(yáng)性，進(jìn)一步說(shuō)明其為真正的MSCs。 3.MSCs在不同大小機(jī)械張應(yīng)力刺激下，低力值時(shí)(400～3000με)成骨相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)，高力值時(shí)(＞3000με)凋亡相關(guān)基因高表達(dá)。 4.單一周期性張應(yīng)力刺激下(2000με)，骨相關(guān)因子在MSCs中表達(dá)增強(qiáng)，其中多數(shù)