骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化和心肌內(nèi)移植的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類可進(jìn)行自我復(fù)制和更新的細(xì)胞，在一定條件下能夠跨胚層向骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)、肌肉等多種譜系分化。多項(xiàng)研究證明，間充質(zhì)干細(xì)胞移植入缺血心臟后可以分化形成新生心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等，還可通過分泌多種生長因子，促進(jìn)微循環(huán)建立，增加血液灌注，提高梗死后心臟功能。將間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化特性應(yīng)用于臨床治療，可能為心肌梗死后的慢性心力衰竭患者帶來新希望。 間充質(zhì)干細(xì)胞可在體外培養(yǎng)中被誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞，具備

2、心肌細(xì)胞的部分表型，表達(dá)心肌特異物質(zhì)，甚至產(chǎn)生自發(fā)跳動。但是有關(guān)人間充質(zhì)干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)較少，誘導(dǎo)后的干細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)以及分子生物學(xué)方面會有何種改變尚缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 干細(xì)胞分化是外界刺激和細(xì)胞內(nèi)特異性信號轉(zhuǎn)錄調(diào)控的共同作用結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，成體干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的過程類似胚胎時(shí)期的表現(xiàn)，某些心肌發(fā)育調(diào)控基因在這一過程中再次被激活，但其表達(dá)規(guī)律如何尚未被闡明。Cripto-1是胚胎心肌發(fā)育時(shí)期不可

3、缺少的調(diào)控因子，但在成體干細(xì)胞分化中是否表達(dá)尚無相關(guān)研究報(bào)道。結(jié)合現(xiàn)有的研究進(jìn)展，我們希望通過誘導(dǎo)純化人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，試圖在以下幾方面有所發(fā)現(xiàn)：(1)5-氮胞苷能否誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞?(2)在誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)以及心肌標(biāo)志物的表達(dá)有何差異?(3)Cripto-1是否也作為調(diào)控因子參與成體干細(xì)胞的分化?希望通過上述問題的研究為闡明干細(xì)胞的分化現(xiàn)象和目的 1．分離、培養(yǎng)

4、較為純化的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：2．觀察經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的形態(tài)改變：3．分別研究誘導(dǎo)后不同時(shí)間心肌特異標(biāo)志物在RNA和蛋白水平的表達(dá)變化；4．研究Cripto-1在干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞過秸中是否表達(dá)及其表達(dá)規(guī)律。 方法 1．人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和純化培養(yǎng) 常規(guī)方法自成人髂后上嵴抽取骨髓約5ml，用生理鹽水將骨髓液稀釋，室溫下500轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，將上清液吸出并緩慢加在等體積的Perc

5、oll分離液上，室溫下400g，離心30分鐘。將白色薄膜狀細(xì)胞層吸出，用PBS(pH7.4)洗3遍(1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘)，棄去液體，用培養(yǎng)基吹打離心管底部的細(xì)胞沉淀，均勻散開后，取10μl滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，置于顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞個數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10<'5>/ml并接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃、含5％C0<,2>的飽和濕度恒溫箱中培養(yǎng)。3天后進(jìn)行首度換液，以后每隔3～4天換液一次，當(dāng)細(xì)胞生長匯合達(dá)80％左右時(shí)，用0.25％

6、的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。連續(xù)傳至第3代后，可以獲得比較純化的間充質(zhì)干細(xì)胞。 2．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外誘導(dǎo) 當(dāng)間充質(zhì)干細(xì)胞傳至第3代時(shí)，在傳代后的第2天向培養(yǎng)基中加入5-aza，調(diào)整終濃度為10 μmol/l，孵育24小時(shí)后更換培養(yǎng)基，并于再次傳代后以相同條件重復(fù)誘導(dǎo)一次。 3．形態(tài)學(xué)觀察 分別在誘導(dǎo)前以及誘導(dǎo)后的不同時(shí)間，在倒置相差顯微鏡下對比觀察在細(xì)胞體積、形態(tài)、生長方式、排列方向和細(xì)胞間連接等各方

7、面的變化，以及肌節(jié)、肌管樣結(jié)構(gòu)的建立等。 4．流式細(xì)胞檢測 應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗體檢測第3代細(xì)胞中CD34和CDl3的陽性表達(dá)百分率。5 免疫熒光檢測取5-氮胞苷誘導(dǎo)4周后的細(xì)胞，分別加入抗心肌肌球蛋白重鏈(myosin heavychain，MHC)多克隆抗體、抗心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTn-I)單克隆抗體、抗心肌轉(zhuǎn)錄因子GATA4多克隆抗體以及抗心肌增強(qiáng)因子2(my

8、ocardiumenhance factor 2，MEF2)多克隆抗體，再加入羅丹明熒光素(TRITC)標(biāo)記的二抗，在熒光倒置顯微鏡下觀察表達(dá)情況。 6．免疫印記(western blot)檢測 分別取誘導(dǎo)后1周、2周、3周和4周的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印記、DAB顯色等步驟，檢測cTn-I、GATA4、MEF2和Cripto-1的表達(dá)，并經(jīng)凝膠成像分析

9、系統(tǒng)半定量檢測表達(dá)水平。 7．實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR)檢測 分別在誘導(dǎo)后1周、2周、3周和4周時(shí)提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)得到eDNA，以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為管家基因，通過real-timePCR技術(shù)檢測cTn-I、GATA4、Nkx2-5和Cripto-1的表達(dá)。 8．透射電鏡檢查 將3％戊二醛固定的細(xì)胞，依次經(jīng)1％鋨酸固定，梯度乙醇脫水，

10、環(huán)氧樹脂包埋等步驟，制作厚約50～80nm的超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛溶液染色，置于銅網(wǎng)上，在H-800透射電鏡下以80～100KV加速電壓，觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，并選取典型視野拍照。 結(jié)果 1．5-aza誘導(dǎo)前后的干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 原代細(xì)胞呈多形性，體積較小，胞核不明顯。流式細(xì)胞檢測顯示細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD13，幾乎不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34。第3代細(xì)胞形態(tài)均一，為長梭狀，貼壁較緊密，胞核

11、大而圓，核漿比較大，呈漩渦樣生長，細(xì)胞間界限清晰。在加入5-aza 24小時(shí)后觀察，部分細(xì)胞死亡。誘導(dǎo)后1周時(shí)，細(xì)胞形態(tài)和生長方式無顯著變化，但可見有少量肌節(jié)樣結(jié)構(gòu)形成。誘導(dǎo)2周后，細(xì)胞形態(tài)變狹長，體積增大，生長方式由明顯的漩渦狀逐漸變?yōu)槠叫信帕袪?，同時(shí)肌節(jié)樣結(jié)構(gòu)增多，可見細(xì)胞間融合現(xiàn)象。誘導(dǎo)3周后，細(xì)胞間排列更為緊密，生長方向一致，有肌管樣結(jié)構(gòu)形成。誘導(dǎo)4周后，形態(tài)改變不明顯。 2．免疫熒光檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)心肌特異標(biāo)志物在

12、熒光倒置顯微鏡下觀察，未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞中cTn-I和MHC未見表達(dá)，誘導(dǎo)4周后可檢測到30％的細(xì)胞中有陽性表達(dá)，表現(xiàn)為胞漿區(qū)呈紅色熒光，而胞核不著色。在未經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞中GATA4和MEF2無表達(dá)；誘導(dǎo)4周后，部分細(xì)胞胞核區(qū)可見GATA4和MEF2陽性，而胞漿不著色。 3．免疫印記技術(shù)檢測誘導(dǎo)前后心肌特異標(biāo)志物在蛋白水平的表達(dá) 心肌特異標(biāo)志物cTn-I以及心肌特異轉(zhuǎn)錄因子GATA4、MEF2在未經(jīng)誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)后1周組的細(xì)胞中均

13、未檢測到表達(dá)；在誘導(dǎo)后2周組，cTn-I、GATA4、MEF2有微弱表達(dá)；在誘導(dǎo)后3周組，GATA4、MEF2、cTn-I的表達(dá)較前升高；在誘導(dǎo)后4周組的細(xì)胞中，各檢測指標(biāo)與前比較表達(dá)未再增強(qiáng)。 Cripto-1在誘導(dǎo)后1周時(shí)，表達(dá)水平最高，第2、3周時(shí)表達(dá)減少，第4周時(shí)幾乎檢測不到。 4．real-time PCR檢測誘導(dǎo)后不同時(shí)間心肌標(biāo)志物及心肌發(fā)育調(diào)控因子在RNA 水平的表達(dá)差異 在誘導(dǎo)后1周時(shí)，細(xì)胞

14、開始微弱表達(dá)GATA4、Nkx2.5和cTn-I。誘導(dǎo)2周、3周和4周后，GATA4、Nkx2．5和cTn-I的表達(dá)水平持續(xù)升高。在誘導(dǎo)后4個不同時(shí)間點(diǎn)之間比較，各檢測位點(diǎn)表達(dá)水平之間具有顯著差異。 Cripto-1的表達(dá)水平在誘導(dǎo)后l周達(dá)到峰值，隨后迅速下降，誘導(dǎo)后4個時(shí)間點(diǎn)的水平之間差異明顯。 5．透射電鏡檢查 在誘導(dǎo)后的部分細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)肌絲樣結(jié)構(gòu)，Z線物質(zhì)散在其中，部分細(xì)胞之間可見類似閏盤樣的連接結(jié)構(gòu)形