炎性因子TNF-α對(duì)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響.pdf

1、目的:
　　探討不同濃度TNF-α對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及其分化成骨的影響，并進(jìn)一步探討TNF-α對(duì)成骨分化過程中BMP-2/Smads信號(hào)通路的調(diào)控作用，初步了解炎癥微環(huán)境下骨折愈合的特殊性。
　　方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定
　　采用全骨髓法分離培養(yǎng)SD大鼠原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物。
　　2、實(shí)驗(yàn)分組
　　實(shí)驗(yàn)分為5組，以在促成骨分化培養(yǎng)基(Osteogenic med

2、ia，OM)中培養(yǎng)的大鼠BMSCs為對(duì)照組，OM中加入不同濃度TNF-α(0.1、1、10、100ng/ml)為實(shí)驗(yàn)組。
　　3、細(xì)胞增殖活性檢測(cè)
　　CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞增值活性。
　　4、堿性磷酸酶活性檢測(cè)
　　AKP試劑盒測(cè)定各組堿性磷酸酶活力。
　　5、鈣結(jié)節(jié)含量檢測(cè)
　　茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色觀察各組鈣結(jié)節(jié)礦化程度。
　　6、Real-Time PCR檢測(cè)
　　采用Real-Tim

3、e PCR檢測(cè)不同濃度TNF-α下BMP-2、Smad1 mRNA的表達(dá)量。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和InstallPrism6圖像分析軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并制圖，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，配對(duì)樣本t檢驗(yàn)用于分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的差異性，以P＜0.05表示為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定:
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)出CD31、CD34、CD44、CD

4、90的陽性表達(dá)率分別為6.09％、8.27％、97.10％、96.67％，證實(shí)所分離培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2、CCK-8結(jié)果顯示:
　　與對(duì)照組(TNF-α=0ng/ml)相比，在加入含TNF-α的礦化誘導(dǎo)液1、3、5、7天后，中高濃度TNF-α(10、100ng/ml)組的BMMSCs增值活性顯著降低(P＜0.05);但是，低濃度TNF-α(1ng/ml)組的細(xì)胞活性在第3天升高后又在第7天顯著降低(P＜0.

5、05)。
　　3、ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示:
　　與對(duì)照組(TNF-α=0ng/ml)相比，在加入含TNF-α的礦化誘導(dǎo)液1、3、5、7天后，中高濃度TNF-α(10、100ng/ml)組的BMMSCs堿性磷酸酶活力顯著降低(P＜0.05）;但是，低濃度TNF-α(1ng/ml)組的細(xì)胞堿性磷酸酶活力在第3天升高后又在第5和第7天顯著降低(P＜0.05)。
　　4、茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色結(jié)果顯示:
　　與對(duì)照組(TNF

6、-α=0ng/ml)相比，在加入含TNF-α的礦化誘導(dǎo)液7天后，低濃度TNF-α(1ng/ml)組BMMSCs礦化結(jié)節(jié)含量無明顯差異（P＞0.05）;中高濃度TNF-α(10、100ng/ml)組BMMSCs鈣結(jié)節(jié)含量減少(P＜0.05，表3、圖10）;在第14天，低中高濃度TNF-α(1、10、100ng/ml)組BMMSCs鈣結(jié)節(jié)含量均減少(P＜0.05)。
　　5、實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示:
　　與對(duì)照組相比，低濃度TN

7、F-α(1ng/ml)組BMP-2 mRNA表達(dá)水平在成骨誘導(dǎo)第3天和第5天分別增加，在培養(yǎng)第7天又下降(P＜0.05)，Smad1 mRNA表達(dá)水平在成骨誘導(dǎo)第3天和第5天分別增加(P＜0.05)，在培養(yǎng)第7天又下降，但是與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。在培養(yǎng)第3、5、7天后，與對(duì)照組相比，中高濃度TNF-α(10、100ng/ml)組BMP-2 mRNA水平顯著增加(P＜0.05），但是Smad1 mRNA表達(dá)水平卻顯著減