雙氯芬酸鈉對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖凋亡及成骨分化的影響.pdf

1、目的：通過不同濃度的雙氯芬酸鈉干預(yù)全骨髓貼壁法培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，觀察雙氯芬酸鈉對(duì)體外培養(yǎng)的SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、凋亡及成骨分化的影響。
　　方法：應(yīng)用全骨髓貼壁法進(jìn)行原代培養(yǎng)，并通過表面抗原和成骨、成脂分化能力鑒定其為BMSCs，并計(jì)算其細(xì)胞倍增時(shí)間。采用不同濃度的雙氯芬酸鈉(6.4mg/L，3.2mg/L，1.6mg/L，0.8mg/

2、L，0.4mg/L)干預(yù)BMSCs，通過MTS法檢測(cè)雙氯芬酸鈉對(duì)BMSCs增殖的影響;通過AnnexinⅤ-FITC法檢測(cè)雙氯芬酸鈉對(duì)BMSCs凋亡的影響。不同濃度的雙氯芬酸鈉干預(yù)BMSCs，AnnexinⅤ/PI雙染法檢測(cè)雙氯芬酸鈉對(duì)BMSCs細(xì)胞周期的影響。不同濃度的雙氯芬酸鈉進(jìn)行干預(yù)誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，21天后茜素紅染色，觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)BMCSs，6.4mg/L的雙氯芬酸鈉干預(yù)，分別在第3天、7天以及14天進(jìn)

3、行ALP染色，并提取總RNA采用RT-PCR法檢測(cè)成骨相關(guān)基因(ALP、OCN和β-actin)的表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)分析:應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析，各試驗(yàn)組資料統(tǒng)計(jì)量均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多樣本均值之間比較采用方差分析，兩兩比較應(yīng)Dunnett-t檢驗(yàn)，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：細(xì)胞倍增時(shí)間約為28小時(shí)。雙氯芬酸鈉藥物干預(yù)細(xì)胞相對(duì)增值率較對(duì)照組明顯下降，細(xì)胞的生長抑制率明顯升高，各組細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)

4、改變（胞漿集中，核較明顯，失去典型的梭型，部分細(xì)胞發(fā)生凋亡，核固縮），上述改變與藥物的濃度呈相關(guān)性。PI染色流式檢測(cè)結(jié)果顯示絕大部分的細(xì)胞停滯在G1/G0期，隨著藥物濃度的升高，進(jìn)入分裂期的細(xì)胞也隨之明顯減少。茜素紅染色發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，隨著雙氯芬酸鈉濃度的上升，鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量呈減少的趨勢(shì)，6.4mg/L組茜素紅染色幾乎沒有鈣結(jié)節(jié)形成。ALP染色結(jié)果顯示與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組的ALP的表達(dá)明顯減少。PCR結(jié)果顯示:在成骨分化誘導(dǎo)的第3天實(shí)驗(yàn)

5、組以及對(duì)照組ALPmRNA、OCNmRNA表達(dá)均較低;在誘導(dǎo)成骨分化第7天，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組ALPmRNA表達(dá)均明顯升高，實(shí)驗(yàn)組ALPmRNA表達(dá)升高趨勢(shì)較弱，OCNmRNA表達(dá)下降明顯，對(duì)照組OCNmRNA表達(dá)與第3天相比基本無差異;成骨分化第14天，對(duì)照組ALPmRNA表達(dá)量出現(xiàn)明顯下降，實(shí)驗(yàn)組ALPmRNA表達(dá)與第7天相比無明顯差異，實(shí)驗(yàn)組OCNmRNA表達(dá)基本無變化。
　　結(jié)論：
　　1、雙氯芬酸鈉能夠明顯抑制大鼠BM