miR-705對絕經后骨質疏松小鼠的骨髓間充質干細胞分化功能異常的調控作用.pdf

1、絕經后骨質疏松(postmenopausal osteoporosis,OPM)是由雌激素水平下降導致的一種全身性代謝性骨疾病,我國老年女性OPM發(fā)病率達50％。其發(fā)病根本原因是由于破骨細胞性骨吸收與成骨細胞性骨形成平衡的失調,造成骨量減少及骨組織結構變化,使得骨脆性增加,從而導致骨折的發(fā)生。并且骨質疏松癥(OP)是造成頜骨骨丟失主要危險因素之一(1),繼而導致牙槽骨吸收、牙齦萎縮、牙根暴露、基牙附著喪失、基牙的松動脫落和頜骨萎縮等一系

2、列不利于口腔修復問題,給口腔義齒修復和種植修復工作帶來了極大的困難。然而目前臨床治療OPM主要采取激素替代、補鈣、抑制骨吸收等方法,但由于藥物毒副作用、吸收不良、藥效不穩(wěn)定、患者順應性差等原因,治療效果尚不理想。
　　骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)是一種來源于中胚層的具有自我更新及多向分化潛能的成體干細胞,通過分化為成骨細胞而在骨發(fā)育、再生和修

3、復中發(fā)揮重要作用。BMMSCs同時是成骨細胞和脂肪細胞的來源細胞,其成骨-成脂分化能力的平衡與骨改建的穩(wěn)態(tài)平衡密切相關。在骨質疏松發(fā)生過程中,BMMSCs成骨分化能力降低而成脂分化能力升高,可能是引發(fā)骨質疏松的原因之一。但對于BMMSCs多向分化的具體調控機制尚不明確。
　　microRNA(miRNA)即小 RNA是近年來新發(fā)現的一類廣泛存在于動物植物體內的非編碼小RNA,能夠以堿基配對方式與靶基因mRNA3′-非翻譯區(qū)結合,在

4、轉錄后水平沉默靶基因的表達,而在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要的調控作用?，F已發(fā)現多種miRNA均參與干細胞的成骨成脂分化過程,對于干細胞命運起著重要調控作用。但是,對于哪些miRNA在BMMSCs中的多向分化中發(fā)揮關鍵作用,miRNA調控BMMSCs分化的分子信號途徑,以及miRNA是否在OPM的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮作用等問題,現在仍不清楚。因此,本實驗利用從正常小鼠和骨質疏松模型小鼠中分離純化的BMMSCs,進行生物學行為比較及mi

5、croRNA微陣列芯片分析,尋找差異性表達的microRNA并進行功能研究,探討特定microRNA在OPM發(fā)病中的作用,從而進一步既加深了對OPM發(fā)病分子機制的理解和明確頜骨骨丟失的根本原因,又為頜骨骨丟失的預防和治療提供了新的思路和方法,進而對臨床中OPM患者口腔修復設計方案的選擇提供了重要的指導作用。
　　研究目的：
　　(1)探討骨質疏松來源的BMMSCs成骨成脂分化能力的改變。
　　(2)探討骨質疏松來源的B

6、MMSCs中microRNA表達譜的變化,尋找出差異性表達的microRNA。
　　(3)探討差異性表達microRNA在BMMSCs成骨成脂分化中所起的作用,并明確其作用的靶基因和分子機制。
　　(4)探討通過恢復差異表達的microRNA的正常表達水平,能否逆轉骨質疏松來源的BMMSCs的異常成骨成脂分化。
　　研究方法：
　　(1)采用卵巢切除法成功建立OPM小鼠模型,使用全骨髓法分離培養(yǎng)骨質疏松來源的BM

7、MSCs(O-BMMSCs)和假手術來源的BMMSCs(S-BMMSCs),通過流式細胞術表面分子鑒定、生長曲線、細胞周期檢測、克隆形成實驗、多向分化誘導實驗,比較兩種干細胞的生物學特性。
　　(2)通過 miRNA微陣列芯片檢測 O-BMMSCs和 S-BMMSCs的miRNA表達譜,利用real-time qRT-PCR法對芯片結果進行驗證,挑選出差異表達miRNA。
　　(3)采用細胞轉染技術過表達和抑制 miR-70

8、5在BMMSCs中的表達水平,并利用MTT、多向分化誘導、茜素紅染色、油紅O染色、qRT-PCR及Western blot,檢測miRNA對BMMSCs增殖及成骨成脂分化能力的調控作用。并通過靶基因預測軟件和生物信息學網站挑選 miR-705的候選靶基因,構建熒光素酶報告基因載體進行靶基因驗證。
　　(4)采用細胞轉染技術下調miR-705在O-BMMSCs中的表達水平,采用油紅O染色、茜素紅染色、qRT-PCR法和Western

9、 blot技術分別觀察其對于O-BMMSCs異常成骨和成脂分化的逆轉作用。
　　研究結果：
　　(1)兩種來源的BMMSCs均表達正常的間充質干細胞表面標志,不表達造血系統(tǒng)來源細胞表面標志,并具有克隆形成能力?？寺⌒纬蓪嶒?、細胞擴增曲線和細胞周期檢測顯示 O-BMMSCs自我更新能力略低于 S-BMMSCs。成骨誘導后,ALP染色、茜素紅染色和成骨相關基因檢測顯示,O-BMMSCs成骨分化能力明顯低于S-BMMSCs;成脂誘

10、導后,油紅O染色和成脂相關基因檢測顯示,O-BMMSCs成脂分化能力明顯高于S-BMMSCs。
　　(2)miRNA微陣列芯片統(tǒng)計分析,篩選出10條 miRNAs在 S-BMMSCs和O-BMMSCs中差異表達,其中 miR-705、miR-3077-5p和 miR-20a差異最為明顯。qRT-PCR結果顯示miR-705的表達在O-BMMSCs中顯著升高,并在正常BMMSCs成骨分化過程中表達下降,在成脂分化過程中表達上升,同時

11、在骨組織內表達豐度高于其他組織。因此選取miR-705進行后續(xù)的功能研究。
　　(3)過表達miR-705和抑制miR-705后對BMMSCs的增殖能力無明顯影響。成骨誘導能力檢測顯示,上調miR-705的表達可顯著降低BMMSCs的成骨能力,而下調miR-705的表達可顯著增加BMMSCs的成骨能力;成脂分化能力檢測顯示,上調miR-705的表達可顯著增強BMMSCs的成脂分化,而下調miR-705的表達可顯著抑制BMMSCs的

12、成脂分化。生物信息學預測Hoxa10和Foxo1為miR-705的候選靶基因,上調miR-705表達后引起二者蛋白表達下調,下調miR-705后引起二者蛋白水平上調,熒光素酶報告基因檢測進一步證明 miR-705可以特異性與 Hoxa10、Foxo1 mRNA3′-非翻譯區(qū)結合。
　　(4)下調miR-705在O-BMMSCs中的表達,能促進Foxo1和Hoxa10及成骨分化關鍵基因的表達,提高O-BMMSCs的成骨分化能力;同時

13、能降低成脂分化關鍵基因的表達,降低O-BMMSCs的異常成脂分化,從而恢復O-BMMSCs的正常分化能力。
　　研究結論：
　　(1)雌激素缺乏所致OPM中,BMMSCs仍保持干細胞的基本特性和能力,但是成骨成脂分化平衡發(fā)生明顯偏移,成骨分化減低而更易于向成脂分化。
　　(2)雌激素缺乏所致OPM中,BMMSCs的miRNA表達出現差異,其中miR-705特異性上升。
　　(3) miR-705通過負向調控靶基因