系統(tǒng)性紅斑狼瘡骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化參與骨質(zhì)疏松機制的在體研究.pdf

1、目的：在體研究狼瘡鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)成骨分化能力缺陷的信號通路調(diào)節(jié)機制，探索SLE骨質(zhì)疏松發(fā)病的新機制。
　　方法：1、分離狼瘡鼠及對照組小鼠腎臟，制備組織切片，HE染色觀察腎臟病變情況。
　　2、全骨髓培養(yǎng)及貼壁篩選法分離培養(yǎng)狼瘡鼠及對照鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀況，選取第3代BMMSCs用于實驗。
　　3、免疫組織化學(xué)法觀察兩組BMMSCs中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、

2、核因子-κB P50(NF-κB P50)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、PSmad1/5/8蛋白表達(dá)情況。
　　4、定向誘導(dǎo)兩組小鼠BMMSCs向成骨細(xì)胞分化，ALP染色鑒定早期成骨情況，RT-PCR法檢測BMMSCs中ALP、Runx2基因mRNA表達(dá)情況。
　　5、將BMMSCs、重組人BMP-2及羥基磷灰石共孵育后包埋入裸鼠皮下，HE染色及Masson Trichome染色觀察異位成骨情況。
　　6、將2組

3、狼瘡鼠分別于皮下注射重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白（益賽普）及生理鹽水，四周后觀察狼瘡鼠BMMSCs其異位成骨能力。
　　結(jié)果：1、HE染色顯示:狼瘡鼠腎小球炎性細(xì)胞明顯浸潤，腎小球增生硬化，腎小管內(nèi)可見大量蛋白管型，提示其病變嚴(yán)重。
　　2、倒置顯微鏡下觀察，狼瘡鼠BMMSCs形成融合單層約需7-10d，而對照組約需5-7d形成融合單層，兩組BMMSCs形態(tài)以短梭形為主，貼壁生長。
　　3、免疫組化結(jié)果顯示:

4、狼瘡鼠BMMSCs TNF-α、NF-κB P50表達(dá)較對照鼠明顯增強(P＜0.01)，而BMP-2、PSmad1/5/8表達(dá)則明顯減弱(P＜0.01)。
　　4、ALP染色及RT-PCR法分別檢測BMMSCs BMP-2誘導(dǎo)下的成骨能力及成骨相關(guān)基因表達(dá)，結(jié)果提示:狼瘡鼠BMMSCs ALP活性較對照組減低，ALP及Runx2基因mRNA表達(dá)水平亦較對照組下調(diào)，提示其在BMP-2誘導(dǎo)下的成骨分化能力減低(P＜0.05)。

5、　　5、BMMSCs異位成骨能力:與對照組相比，狼瘡鼠組BMMSCs的皮下異位成骨包塊體積減小，HE及Masson Trichome染色顯示，狼瘡鼠BMMSCs的骨基質(zhì)生成量比對照明顯減少，Masson Trichome染色發(fā)現(xiàn)其類骨質(zhì)較多，表明其骨的成熟度比較低，而予注射益賽普后狼瘡鼠BMMSCs的異位成骨能力較前有所恢復(fù)。
　　結(jié)論：1、狼瘡鼠BMMSCs體外生長、分化能力較正常鼠BMMSCs減低。
　　2、狼瘡鼠BMM