EB1089修復(fù)初治系統(tǒng)性紅斑狼瘡缺陷間充質(zhì)干細(xì)胞的作用研究.pdf

1、目的：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是以自身免疫介導(dǎo)，免疫性炎癥為表現(xiàn)，全身多器官受累為特征的彌漫性結(jié)締組織病。近年來“SLE間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell，MSC)缺陷學(xué)說”在其機(jī)制研究中是一個(gè)熱門觀點(diǎn)。免疫紊亂是SLE發(fā)病的核心，免疫細(xì)胞及相關(guān)因子在輸出骨髓前出現(xiàn)異常，或者說造血干細(xì)胞分化，發(fā)育成免疫細(xì)胞過程中出現(xiàn)缺陷，引起后續(xù)SLE疾病發(fā)生的連鎖反應(yīng)是M

2、SC缺陷學(xué)說的立據(jù)。MSC是骨髓造血微環(huán)境最重要的部分，其數(shù)量增殖，多向分化功能，基礎(chǔ)細(xì)胞因子分泌均是為穩(wěn)定造血干細(xì)胞健康生長(zhǎng)提供保障的基礎(chǔ)。MSC一旦出現(xiàn)缺陷就會(huì)破壞骨髓基質(zhì)微環(huán)境平衡，之后對(duì)造血干細(xì)胞產(chǎn)生繼發(fā)損傷，尤其是對(duì)免疫細(xì)胞有重要的影響，對(duì)機(jī)體免疫抑制，免疫耐受等作用減弱，參與SLE的疾病進(jìn)程。但目前有關(guān)SLE骨髓MSC基本屬性缺陷的研究結(jié)論不完全一致。一方面研究顯示SLE患者體內(nèi)MSC存在數(shù)量缺陷，骨架形態(tài)改變，多向分化潛能

3、異常，基礎(chǔ)細(xì)胞因子分泌缺陷。但另一方面研究則指出與健康人相比SLE病人骨髓MSC在上述屬性中無顯著差異，出現(xiàn)缺陷的原因是長(zhǎng)期病程，激素聯(lián)合免疫抑制藥物應(yīng)用等共同作用的繼發(fā)結(jié)果。但上述研究中缺乏對(duì)初診，年輕病人的實(shí)驗(yàn)觀察，無法判斷SLE MSC缺陷是否是“自帶屬性”，此外目前針對(duì)MSC缺陷的輔助治療以異基因移植為主，但外源植入捐贈(zèng)者骨髓，其可變性、排斥反應(yīng)及細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)中MSC功能性質(zhì)和遺傳不穩(wěn)定性對(duì)于長(zhǎng)期預(yù)后仍是個(gè)讓人擔(dān)憂的問題，那么能

4、否通過藥物治療使SLE缺陷MSC在基本屬性上得到修復(fù)也是我們感興趣的問題。維生素D是一種能夠廣泛發(fā)揮多種生物學(xué)功能，藥理活性的甾體激素，在體內(nèi)以1，25(OH)2D3的活性形式與維生素D受體(Vitamin D receptor，VDR)結(jié)合，再與維甲酸X受體結(jié)合成二聚體，作用于細(xì)胞內(nèi)不同靶反應(yīng)元件，調(diào)控多種生理學(xué)功能，也能夠直接作用于靶細(xì)胞，對(duì)正常MSC的增殖和分化可能發(fā)揮一定作用，但具體機(jī)制尚不明確。臨床上主要應(yīng)用穩(wěn)定性好，高鈣血癥

5、等不良反應(yīng)小的活性維生素D類似物來實(shí)現(xiàn)治療，EB1089就是其中一種。研究發(fā)現(xiàn)除了經(jīng)典鈣磷調(diào)節(jié)作用外，EB1089主要通過結(jié)構(gòu)改變，分離和加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞增殖，分化，組織修復(fù)等藥效方面的功能，并在不同作用濃度，不同干預(yù)時(shí)間，對(duì)不同種屬來源的細(xì)胞發(fā)揮諸如抗衰老，抗氧化，抑制炎癥，免疫調(diào)節(jié)，細(xì)胞修復(fù)，抗腫瘤等多種藥理學(xué)作用。近年來還發(fā)現(xiàn)維生素D類藥物對(duì)造血微環(huán)境細(xì)胞因子分泌有調(diào)節(jié)作用，還可能直接作用造血干細(xì)胞促進(jìn)其數(shù)量增殖。那么結(jié)合EB1089在

6、促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子等方面的多重藥理活性和對(duì)SLE MSC缺陷的已有認(rèn)識(shí)，EB1089能否成為MSC的細(xì)胞修復(fù)劑，從而改善SLE疾病進(jìn)程。
　　方法：收集初診、青年、女性SLE病人骨髓標(biāo)本20例，健康對(duì)照骨髓標(biāo)本10例，排除感染，腫瘤，長(zhǎng)期慢性疾病及其他自身免疫系統(tǒng)疾病，體外行MSC分離培養(yǎng)鑒定。觀察兩組骨髓MSC在形態(tài)，表型，生長(zhǎng)的不同并分別繪制生長(zhǎng)曲線。MTT法比較兩組MSC數(shù)量的差異及EB1089對(duì)SLE組M

7、SC增殖的影響。進(jìn)一步誘導(dǎo)MSC成骨分化，行堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)活性測(cè)定和茜素紅半定量試驗(yàn)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real Time Polymerase chainreaction，Real time PCR)和免疫印跡法(Western blot，WB)檢測(cè)Runx2 mRNA及蛋白表達(dá)比較兩組MSC成骨分化的差異及EB1089對(duì)SLE組MSC成骨的影響。留取培養(yǎng)上清液并收集細(xì)胞，酶聯(lián)免

8、疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)白介素6(Interleukin6，IL-6)，IL-11，腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα，TNF-α)，干擾素γ(Interferonγ，IFN-γ)的水平，real time PCR測(cè)定轉(zhuǎn)錄水平mRNA表達(dá)比較兩組MSC細(xì)胞因子分泌的差異及EB1089對(duì)基礎(chǔ)細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSC內(nèi)活性氧(

9、Reactive oxygen species，ROS)水平的變化，Western blot檢測(cè)Smad1，Smad5，Smad8，磷酸化Smad1/5/8，核因子kB抑制劑(Nuclear factor-kappaB inhibitor，IkB)，磷酸化IkB蛋白表達(dá)探索EB1089修復(fù)MSC的機(jī)制。
　　結(jié)果：成功分離、培養(yǎng)正常組和初治，青年SLE組的骨髓MSC，鏡下觀察兩組MSC在形態(tài)上無顯著差異，表型一致均表達(dá)CD105，

10、CD73，CD90，不表達(dá)CD45，CD34。SLE組原代和P1代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間明顯長(zhǎng)于正常組(24.9±0.73&14.2±0.66天，14.2±1.48&7.0±0.70天，p＜0.001)。生長(zhǎng)曲線顯示兩組整體生長(zhǎng)趨勢(shì)無差異，但SLE組同期細(xì)胞數(shù)量卻較正常組明顯減少。MTT顯示初治、青年SLE組的骨髓MSC相對(duì)數(shù)量明顯少于正常組（0.258±0.004&0.448±0.007，p＜0.001)。EB1089濃度(1，10，100，1

11、000) pM干預(yù)后，SLE組細(xì)胞數(shù)量均有增加(0.322±0.009&0.372±0.004&0.438±0.007&0.441±0.042)，有一定濃度依賴性，以EB1089濃度100pM，1000pM時(shí)作用最為顯著，但兩個(gè)濃度作用之間無顯著差異(p＞0.05)。然后我們誘導(dǎo)兩組MSC成骨分化，從ALP和茜素紅染色結(jié)果分析SLE組成骨能力明顯下降，在基質(zhì)成熟期和礦化期，初治，青年SLE組ALP活性和茜素紅半定量結(jié)果較正常組明顯下降(

12、9.21±0.53&27.42±3.15ng/l，p＜0.001)，（0.23±0.00&0.65±0.01，p＜0.001）。成骨特異基因Runx2 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)較正常組也明顯減少（0.55±0.14&2.25±0.66，p＜0.001），（1.52±0.13&3.11±0.25 p＜0.001）。SLE組在EB1089濃度(1，10，100，1000) pM干預(yù)后，ALP活性，茜素紅半定量結(jié)果，Runx2 mRNA及蛋白表

13、達(dá)均有明顯增加，(17.70±4.91&25.16±0.95&27.17±1.38&27.37±1.90ng/l)，（0.35±0.02&0.42±0.04&0.63±0.02&0.66±0.03），(0.98±0.27&1.63±0.15&1.93±0.38&2.07±0.98)，（2.31±0.16&2.81±0.15&3.60±0.14&3.47±0.38）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們采用ELISA法檢測(cè)兩組MSC基礎(chǔ)細(xì)胞因子分泌水平，

14、結(jié)果提示初治，青年SLE組IL-6， IL-11，TNF-α， IFN-γ的水平明顯高于正常組[（194.97±44.11&104.11±22.57），（430.00±145.45&254.71±62.89），p＜0.01][（58.10±14.99&27.07±9.26），（69.59±17.75&34.11±5.99），p＜0.001]，EB1089干預(yù)能夠降低TNF-α，IFN-γ的水平p＜0.05，對(duì)IL-6，IL-11的水平無

15、影響(p=0.87，p=0.42)。Real time PCR在轉(zhuǎn)錄水平同樣證實(shí)了上述結(jié)論。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)初治、青年SLE組骨髓MSC內(nèi)ROS水平較正常組明顯升高（192.15±10.78&75.76±8.34，p＜0.0001）。EB1089濃度(1，10，100，1000)pM干預(yù)后ROS水平均有下降(149.69±9.18&139.46±10.05&103.98±11.77&99.78±10.30)，有一定濃度依賴性，與SLE

16、組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。WB結(jié)果顯示正常組，SLE組，EB1089干預(yù)組Smad1，5，8蛋白表達(dá)無顯著差異p＞0.05，但磷酸化Smad1/5/8蛋白在SLE組表達(dá)明顯減弱，與正常組及EB1089對(duì)照組比較P＜0.05，EB1089干預(yù)后其表達(dá)有所增加，提示EB1089能夠活化BMP通路。而初治，青年SLE組IkB-a蛋白表達(dá)減弱，而磷酸化IkB-a表達(dá)相對(duì)增強(qiáng)，與正常組及EB1089對(duì)照組比較P＜0.05，EB1089干預(yù)后增加IkB-

17、a蛋白表達(dá)并抑制磷酸化IkB-a表達(dá)，提示EB1089能夠抑制核轉(zhuǎn)錄因子kB(Nuclear factor kappaB，NF-kB)通路。
　　結(jié)論：⑴初治，青年SLE骨髓MSC存在數(shù)量缺陷，表現(xiàn)為增殖減低，倍增周期延長(zhǎng);成骨分化不足，表現(xiàn)為成骨數(shù)量減慢，成熟及礦化減低，成骨相關(guān)蛋白表達(dá)減低;基礎(chǔ)細(xì)胞因子分泌異常，表現(xiàn)為IL-6，IL-11等造血支持因子代償性增加，TNF-α，IFN-γ等造血負(fù)向調(diào)節(jié)因子/促炎因子自發(fā)顯著增加。

18、這些基本屬性缺陷是SLE的“自帶屬性”，與藥物干預(yù)，長(zhǎng)期病程，年齡誘發(fā)的細(xì)胞衰老等因素?zé)o關(guān)，但是與MSC的功能發(fā)揮息息相關(guān)。⑵EB1089能夠促進(jìn)SLE缺陷MSC的數(shù)量增殖，增加MSC成骨分化中ALP活性，基質(zhì)礦化能力，Runx2成骨因子的表達(dá)，促進(jìn)MSC成骨分化，并且能夠抑制TNF-α，IFN-γ等造血負(fù)向調(diào)節(jié)因子/促炎因子的分泌，對(duì)IL-6，IL-11等造血支持因子代償增加無顯著影響。⑶EB1089對(duì)SLE骨髓MSC基本屬性缺陷具有

19、修復(fù)作用，機(jī)制可能與降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致的DNA持續(xù)損傷，抑制NF-kB信號(hào)通路，活化BMP/Smad1/5/8信號(hào)通路有關(guān)⑼⑷目前在SLE臨床治療過程中，維生素D類藥物仍僅僅作為骨質(zhì)疏松預(yù)防的一種治療。本研究證實(shí)了維生素D類似物EB1089對(duì)SLE缺陷MSC的修復(fù)作用并探索了可能機(jī)制，在原有治療基礎(chǔ)上聯(lián)合針對(duì)缺陷MSC的修復(fù)治療可能更加有利于SLE疾病的緩解和預(yù)后，為維生素D類藥物未來在SLE治療應(yīng)用找到新的論據(jù)，我