利用新的丁內(nèi)酯衍生物研究血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與老化關(guān)聯(lián)及空泡化的機(jī)制.pdf

1、血管內(nèi)皮細(xì)胞控制著血管功能，其功能紊亂會導(dǎo)致各種心血管疾病。本論文旨在以血管內(nèi)皮細(xì)胞為模型來研究凋亡與老化的關(guān)系及空泡化的機(jī)制。 本課題組在以前的研究中發(fā)現(xiàn)去除血清和生長因子誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)凋亡，那么，與此同時，細(xì)胞是否也發(fā)生了老化，本論文對此進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)去除血清和生長因子也能誘導(dǎo)HUVECs老化。接著從化學(xué)遺傳學(xué)角度出發(fā)，以去除血清和生長因子的HUVECs為模型，新的丁內(nèi)酯衍生物3-芐基-5-(2-硝基

2、苯氧甲基)-γ-丁內(nèi)酯為工具，對可能關(guān)聯(lián)凋亡和老化的重要因子做了研究。 空泡化與細(xì)胞凋亡、壞死有密切關(guān)系，可能在老化過程中也有作用，所以對其機(jī)制的研究有重要的意義，本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)低濃度的氯代奎寧(CQ)在人肺腺癌A549細(xì)胞中能誘導(dǎo)空泡化，但其在HUVECs中的作用尚不清楚，由此研究了CQ是否能誘導(dǎo)HUVECs的空泡化，并發(fā)現(xiàn)CQ(8μM to 32/μM)可以誘導(dǎo)HUVECs的空泡化，而且其作用是劑量依賴性的。接著為研究

3、能夠影響CQ誘導(dǎo)的空泡化的新因子，研究了3BDO對CQ誘導(dǎo)的空泡化的影響。 研究方法： 1.血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取和培養(yǎng)，參考Jaffeetal方法 2.倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化 3.MTT檢測細(xì)胞生長率 4.吖啶橙染色結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，檢測細(xì)胞核凝集 5.nJNEL染色檢測DNA片段化和凋亡率 6.SA-β-半乳糖苷酶染色檢測細(xì)胞的老化程度 7.免疫熒光化學(xué)

4、檢測膜整連蛋白β4的表達(dá) 8.熒光探針DCHF檢測ROS表達(dá)水平 9.中性紅吸收法檢測溶酶體空泡化程度 10.Na<'+>K<'+>-ATP酶活性檢測試劑盒檢測Na<'+>K<'+>-ATP酶活性。 研究結(jié)果： 1．去除血清和生長因子不但能誘導(dǎo)HuVECs的凋亡，也能誘導(dǎo)其老化。 2．3BDO(60-18μM)抑制此種情況下HUVECs的凋亡和老化。 3．3BDO(60-18μM)

5、抑制此過程中膜整連蛋白β4水平的升高。 4．3BDO(60-18μM)不影響細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。 5．CQ(8μM-32μM)能以劑量依賴的方式誘導(dǎo)HUVECs的空泡化。 6．3BDO(6μM-18μM)抑制CQ誘導(dǎo)的空泡化，及酸性區(qū)室總體積(VAC)的增加。 7．CQ能增強(qiáng)Na<'+>K<'+>-ATP酶的活性，而3BDO對此也有抑制作用。 結(jié)論 1．本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)除了凋亡外，去除血清和F

6、GF-2也能誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生老化。此結(jié)果與血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和老化相平行的觀點(diǎn)相一致。 2．本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)新的小分子化合物3BDO能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和老化，這為研究凋亡與老化的關(guān)系提供了一個有效的工具。 3．膜整連蛋白β4參與3BDO的抗凋亡和老化作用，說明它可能是細(xì)胞凋亡和老化的信號交聯(lián)中的一個重要因子。 4．在3BDO的抗凋亡和老化作用的過程中，ROS的水平未受到影響，提示在血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和老