R-spondin 2-LGR4増強(qiáng)Wnt-p-catenin信號通路促進(jìn)骨質(zhì)疏松后骨重建的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：R-spondin2促進(jìn)骨形成的機(jī)制研究
　　目的：
　　R-spondin2是最新發(fā)現(xiàn)的W n t信號激動(dòng)劑R-spondins蛋白家族成員之一。本研究的目的是通過體外細(xì)胞研究觀察重組人R-spondin2蛋白因子對經(jīng)典的W n t信號通路活性、礦化結(jié)節(jié)和成骨細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)的影響。
　　材料與方法：
　　成骨前細(xì)胞MC3T3-E1誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)，不同濃度重組R-spondin2、Dkk-K W nt3

2、a蛋白因子處理細(xì)胞。Westem-blot檢測Wnt信號通路相關(guān)蛋白（活性卩-catenin、磷酸化-Lrp5)表達(dá)；ALP染色和活性測定實(shí)驗(yàn)檢測A L P活性，Real-time P C R和 Westem-blot分別檢測成骨細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA和蛋白表達(dá)；Alizarin Red檢測礦化結(jié)節(jié)形成；熒光素酶報(bào)告基因檢測W nt信號活性。
　　結(jié)果：
　　不同濃度重組R-spondin2蛋白因子處理MC3T3-E1細(xì)胞，A

3、 L P活性明顯升髙，并且在100ng/ml濃度時(shí)達(dá)到平臺期，礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量和面積明顯增加，同時(shí)成骨細(xì)胞標(biāo)志基因OPG、Osterix和 Runx2表達(dá)明顯升髙，但是 RANKL基因表達(dá)未受影響，RANKL/OPG比值降低。Western b lo t檢測發(fā)現(xiàn)R-spondin2處理的細(xì)胞中活性P-catenin蛋白表達(dá)水平明顯升高，細(xì)胞免疫熒光提示活性P-catenin蛋白由細(xì)胞楽向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。而當(dāng)加入Dkk-1時(shí)，R-spondi

4、n2促進(jìn)活性P-catenin蛋白表達(dá)的作用受到抑制，同時(shí)成骨相關(guān)基因表達(dá)、礦化結(jié)節(jié)形成、A L P活性和W n t信號活性受到抑制；加入W n t3 a時(shí)，活性P-catenin蛋白表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，同時(shí)成骨相關(guān)基因表達(dá)、礦化結(jié)節(jié)形成、A L P活性和W n t信號活性進(jìn)一步明顯增強(qiáng)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)提示R-spondin2對W n t信號的活性有積極的影響，同時(shí)加入低劑量的Wnt3a，能夠顯著放大W n t信號活性，然而Dkk-1能夠

5、明顯消除R-spondin2對W n t信號活化作用。
　　結(jié)論：
　　R-spondin2能夠通過活化經(jīng)典W n t信號通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和成熟，誘導(dǎo)骨形成。
　　第二部分：L G R4在R-spondin2調(diào)節(jié)骨形成過程中作用研究
　　目的：
　　目前研究認(rèn)為L G R4為 R-spondins的二級受體。本研究的目的是觀察L G R4在 R-spondin2誘導(dǎo)骨形成過程中的作用。
　　材料

6、與方法：
　　分離和培養(yǎng)原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMCs)，Real-time PCR檢測BMCs和 MC3T3-E1細(xì)胞中LGR4，5,6基因表達(dá)。不同濃度R-spondin2刺激MC3T3-E1細(xì)胞，Westem-blot檢測磷酸化-CREB和 A tf4蛋白表達(dá)。構(gòu)建 LGR4 shRNA慢病毒建立穩(wěn)定的LGR4_/_MC3T3-E1細(xì)胞系，100ng/ml重組R-spondin2蛋白因子刺激LGR4_AMC3T3-E1細(xì)胞，

7、誘導(dǎo)成骨分化，Alizarin Red染色檢測礦化結(jié)節(jié)形成，A L P染色和A L P活性測定檢測A L P活性變化，Real-time P C R和 Westem-blot檢測成骨細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)，Westem-blot檢測磷酸化-Lrp5、ZNRF3、活性p-catenin蛋白表達(dá)’熒光素酶報(bào)告基因檢測W nt信號活性。
　　結(jié)果：
　　Real-time P C R結(jié)果提示B M C s和 MC3T3-E1細(xì)胞中L G

8、 R4基因表達(dá)水平顯著高于LGR5、LGR6基因表達(dá)水平。Westem-blot分析發(fā)現(xiàn)R-spondin2對磷酸化-CREB和Atf4蛋白表達(dá)無明顯影響。干擾MC3T3-E1細(xì)胞的LGR4基因功能，對 LGR5和 LGR6蛋白表達(dá)無明顯影響，但是R-spondin2失去對礦化結(jié)節(jié)形成、A L P活性以及成骨細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)的積極誘導(dǎo)作用，同時(shí)R-spondin2失去了對W n t信號通路相關(guān)蛋白磷酸化-Lrp5和活性P-catenin

9、蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，并且R-spondin2失去對Z N R F3蛋白表達(dá)的抑制作用。盡管L G R4基因缺失，R-spondin2仍然能夠?qū)ΦV化結(jié)節(jié)形成、A L P活性和成骨細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)存在輕微的促進(jìn)作用。這些結(jié)果提示，R-spondin2可能通過替換受體L G R5和L G R6發(fā)揮作用。熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)一步證實(shí)，R-spondin2對LGR4_aMC3T3-E1細(xì)胞中的W n t信號活性無明顯影響。
　　結(jié)論：

10、>　　L G R4在 R-spondin2活化W n t信號通路，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和成熟，促進(jìn)骨形成的過程中扮演關(guān)鍵的受體作用。
　　第三部分：R-spondin2調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化成熟的機(jī)制研究
　　目的：
　　骨形成的過程中需要成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共同參與。本研究的目的是觀察外源性R-spondin2蛋白因子對破骨細(xì)胞分化和成熟的影響。
　　材料和方法：
　　建立成骨細(xì)胞/破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系，100ng/m

11、l R-spondin2蛋白因子加入到共培養(yǎng)體系中，ELISA檢測培養(yǎng)液中OPG、RANKL蛋白濃度變化，TRAP染色觀察多核細(xì)胞，23個(gè)核被認(rèn)為是破骨細(xì)胞，顯微鏡計(jì)數(shù)，Real-time P C R檢測破骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因T r a p和破骨細(xì)胞融合相關(guān)基因Cd47表達(dá)變化；同時(shí)加入重組RANKL蛋白因子，中和R-spondin2介導(dǎo)分泌的OPG蛋白，TRAP染色觀察多核細(xì)胞，顯微鏡計(jì)數(shù)，Real-time P C R檢測Trap和

12、Cd47基因表達(dá)變化。建立LGR4 A MC3T3-E1細(xì)胞/破骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系，100ng/ml R-spondin2蛋白因子加入到共培養(yǎng)體系中，ELISA檢測培養(yǎng)液中OPG、RANKL蛋白濃度變化，TRAP染色觀察多核細(xì)胞，顯微鏡計(jì)數(shù)，Real-time PCR檢測Trap和 Cd47基因表達(dá)變化。破骨細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，100ng/ml R-spondin2刺激細(xì)胞，TRAP染色觀察多核細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)，Real-time PCR檢測

13、Trap和Cd47基因表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　R-spondin2刺激共培養(yǎng)體系，培養(yǎng)液中O P G蛋白濃度明顯升高，而 R A N K L蛋白濃度無明顯變化，RANKL/OPG比值降低，破骨細(xì)胞標(biāo)志基因Trap和 Cd47表達(dá)降低，破骨細(xì)胞分化和成熟受到抑制，破骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少；加入RANKL蛋白因子，破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加，Trap和 Cd47表達(dá)明顯升高，R-spondin2對破骨細(xì)胞分化和成熟的抑制作用被中和。當(dāng)

14、 LGR4_AMC3T3-E1細(xì)胞/破骨細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，破骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加，Trap和 Cd47表達(dá)明顯升高，R-spondin2對破骨細(xì)胞分化和成熟的抑制作用消失。而當(dāng)破骨細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，R-spcmdin2對破骨細(xì)胞分化和成熟無明顯影響。
　　結(jié)論：
　　R-spondin2抑制破骨細(xì)胞形成需要L G R4基因功能正常表達(dá)的成骨細(xì)胞存在。
　　第四部分：R-spondin2對卵巢切除骨質(zhì)疏松小鼠骨代謝和骨微結(jié)構(gòu)影響

15、的觀察研究
　　目的：
　　體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)外源性R-spondin2蛋白因子能夠促進(jìn)骨形成。本研究的目的是體內(nèi)注射外源性R-spondin2蛋白因子，觀察卵巢切除骨質(zhì)疏松小鼠骨代謝和骨微結(jié)構(gòu)的變化。
　　材料和方法：
　　72只雌性6周齡C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為卵巢切除組、卵巢切除+R-spondin2組、假手術(shù)組、假手術(shù)+R-spondin2組，皮下注射重組R-spondin2蛋白因子8周后，E L I S

16、A檢測血清O C N、Tracp5b、OPG和 RANKL蛋白濃度，TRAP染色和ALP染色分別檢測脛骨近端骨小梁周圍破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞數(shù)量及面積變化，鹽酸四環(huán)素鹽標(biāo)記檢測骨礦化沉積率（MAR)和新骨形成率（B F R)，免疫組織化學(xué)分析腰椎骨小梁周圍成骨細(xì)胞中活性P-catenin蛋白表達(dá)，microCT分析脛骨近端骨微結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果：
　　R-spondin2治療卵巢切除小鼠8周后，血清O C N、Tracp5b、

17、O P G和 R A N K L水平被逆轉(zhuǎn)，RANKL/OPG比值降低，骨小梁周圍破骨細(xì)胞數(shù)量和面積明顯減少，M A R和 B F R明顯增加，骨微結(jié)構(gòu)明顯改善。盡管骨小梁周圍成骨細(xì)胞的數(shù)量和面積增加趨勢并不明顯，但是成骨細(xì)胞中活性p-catenin蛋白水平明顯增加。同時(shí)，R-spondin2促使正常小鼠的骨合成代謝增加，脛骨近端破骨細(xì)胞數(shù)量和面積減少，骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)BV/TV、Tb.N和Tb.Th明顯增加，Tb.Sp明顯降低。