骨質(zhì)疏松癥脂肪干細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)差異基因篩選的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:骨質(zhì)琉松小鼠模型建立及骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定
　　目的:骨質(zhì)疏松病(Osteoporosis)的發(fā)病機(jī)制在于骨重建過(guò)程中成骨活動(dòng)下降，破骨活動(dòng)上升，導(dǎo)致骨代謝平衡被破壞，骨組織吸收大于形成。最終導(dǎo)致密質(zhì)骨變薄，骨小梁密度減低，骨質(zhì)疏松，骨折發(fā)生幾率增加，骨愈合能力降低[1]。脂肪干細(xì)胞來(lái)源豐富，易于獲取，以往對(duì)于脂肪干細(xì)胞的研究已證實(shí)該細(xì)胞具有骨向分化的潛能[2]，而骨質(zhì)疏松脂肪干細(xì)胞是否具有同樣的成骨能力

2、尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠骨質(zhì)疏松模型，分離培養(yǎng)建模成功的骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞(OP-ASCs)。為研究骨質(zhì)疏松癥脂肪干細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)差異基因篩選的實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞支持。
　　方法:①將雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（去勢(shì)組）和對(duì)照組（假手術(shù)組）。去勢(shì)組取10周齡小鼠（體重18～20克），切除雙側(cè)卵巢。術(shù)后4w、8w，從去勢(shì)組和假手術(shù)組隨機(jī)選取6只小鼠，麻醉后，采用micro-CT測(cè)定股骨中間骨干的骨體積分?jǐn)?shù)（bo

3、ne volume fraction，BV/TV，％），通過(guò)對(duì)照上述指標(biāo)從影像學(xué)角度證明骨質(zhì)疏松小鼠造模成功。再?gòu)娜?shì)組和假手術(shù)組中隨機(jī)選取6只小鼠，取其膝關(guān)節(jié)進(jìn)行切片及HE、MASSON染色，通過(guò)觀察其骨小梁密度、骨密質(zhì)厚度判斷造模成功與否。②頸椎脫法處死小鼠，75％酒精浸泡小鼠進(jìn)行全身消毒，取上述骨質(zhì)疏松小鼠腹股溝脂肪組織，使用組織塊法將小鼠脂肪組織剪碎，翻轉(zhuǎn)干涸，于含10％FBSα-MEM培養(yǎng)基中進(jìn)行小鼠OP-ASCs原代培養(yǎng)，酶

4、消化法進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代至第二代時(shí)，得出所需骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞。③所得骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，證明其干細(xì)胞特性。
　　結(jié)果:從影像學(xué)及組織學(xué)方面證明去勢(shì)法構(gòu)建骨質(zhì)疏松小鼠模型成功，通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其干細(xì)胞表面抗體為陽(yáng)性，符合干細(xì)胞特性，證明組織塊法自骨質(zhì)疏松小鼠腹股溝脂肪取得的細(xì)胞確為骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞。
　　結(jié)論:通過(guò)去勢(shì)法我們成功建立了骨質(zhì)疏松小鼠動(dòng)物模型，自取得的

5、骨質(zhì)疏松小鼠腹股溝取得OP-ASCs。
　　第二部分骨質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路的變化情況
　　目的:以往研究證實(shí)Wnt信號(hào)通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、正常的脂肪干細(xì)胞的骨向分化中起著至關(guān)重要的作用[3-5]，但在OP-ASCs中，Wnt信號(hào)通路是否與在其他種類的干細(xì)胞中一樣扮演著重要的角色，并且如果Wnt信號(hào)通路在OP-ASCs中同樣扮演著調(diào)控成骨的作用，其骨向分化的調(diào)控的具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。本研

6、究目的在于通過(guò)上調(diào)及下調(diào)Wnt信號(hào)通路，篩選出Wnt信號(hào)通路中基因差異性表達(dá)出的關(guān)鍵因子，從而與現(xiàn)有研究的其他干細(xì)胞中的Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵因子變化進(jìn)行比較，并探究Wnt信號(hào)通路對(duì)OP-ASCs骨向分化的調(diào)控的具體分子機(jī)制，為骨質(zhì)疏松脂肪干細(xì)胞修復(fù)骨缺損等臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:將小鼠重組DKK-1蛋白按照0.1μg/ml加入含10％FBSα-MEM培養(yǎng)基，LiCl以50mg/ml加入含10％FBSα-MEM培養(yǎng)基，將骨

7、質(zhì)疏松小鼠脂肪干細(xì)胞分為L(zhǎng)iCl處理組、DKK-1處理組，并設(shè)置用10％FBSα-MEM培養(yǎng)基的對(duì)照組，在第一天、第三天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)提取細(xì)胞的總RNA，以Wnt信號(hào)通路PCR芯片結(jié)合Real-time PCR篩選出其中的Wnt信號(hào)通路有關(guān)的差異性基因。
　　結(jié)果:第一天時(shí)，LiCl組小鼠OP-ASCs與對(duì)照組相比，Ccnd1基因表達(dá)上調(diào)，Porcn、Sfrp1、Sfrp2、Sfrp4、Wnt5a基因表達(dá)降低，而DKK-1組小鼠OP-

8、ASCs與對(duì)照組相比，Axin1、Fzd6、Wnt5a基因表達(dá)上調(diào)。第三天時(shí)，LiCl組小鼠OP-ASCs與對(duì)照組相比，Wnt2基因表達(dá)水平上調(diào)，Nlk、Porcn、Wnt5a基因表達(dá)水平下調(diào);DKK-1組小鼠OP-ASCs與對(duì)照組相比，Wif1、Wnt5a基因表達(dá)水平上調(diào)。
　　結(jié)論:1.在OP-ASCs中，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路同樣在調(diào)控這些基因的表達(dá)，我們推測(cè)LiCl的加入上調(diào)了OP-ASCs中激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的Wnt2基

9、因表達(dá)，下調(diào)了抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的Porcn、Sfrp1、Sfrp2、Sfrp4基因，激活了經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，從而使其下游基因Ccnd1表達(dá)上調(diào);而DKK-1的加入上調(diào)了經(jīng)典Wnt信號(hào)通路抑制劑Axin1、Wif1基因，從而抑制了經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。2.LiCl的加入下調(diào)了非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵因子Wnt5a、Nlk基因表達(dá)，從而抑制了非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，而DKK-1的加入上調(diào)了非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵因子Wnt5a、Fz