Islet-1促C3H10T1-2向心肌細(xì)胞分化過(guò)程中電生理特性研究.pdf

1、目的：
　　用 Islet-1慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 C3H10T1/2細(xì)胞，使其高表達(dá)Islet-1，特異性誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)誘導(dǎo)后各組細(xì)胞鈉鉀鈣離子通道編碼基因以及細(xì)胞膜離子通道電流的表達(dá)情況，分析明確Islet-1可誘導(dǎo)C3H10T1/2分化為具有電生理功能的心肌樣細(xì)胞。
　　方法：
　　復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)C3H10T1/2細(xì)胞，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞按1×104/孔接種于24孔板內(nèi)，待細(xì)

2、胞融合至70％時(shí)加入慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染慢病毒后細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)以及細(xì)胞形態(tài)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率，并用western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染慢病毒后Islet-1表達(dá)情況；差速貼壁法分離培養(yǎng)新生小鼠心肌細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光法鑒定心肌細(xì)胞純度；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞鈉鉀鈣離子通道編碼基因表達(dá)水平，并采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜鈉鉀鈣離子通道電流的表達(dá)，與空白對(duì)照

3、組（未處理的 C3H10T1/2細(xì)胞），陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染空慢病毒載體組)，以及陽(yáng)性對(duì)照組（新生小鼠心肌細(xì)胞）進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染慢病毒后96h，熒光顯微鏡可見(jiàn)細(xì)胞已表達(dá)綠色熒光蛋白；熒光表達(dá)穩(wěn)定后流式檢測(cè)陰性組對(duì)照組慢病毒轉(zhuǎn)染效率為89%，實(shí)驗(yàn)組慢病毒轉(zhuǎn)染效率為74.31%；觀察轉(zhuǎn)染慢病毒后4周，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞排列雜亂，形態(tài)無(wú)明顯差異，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)多處細(xì)胞排列緊密、方向趨于一致，形態(tài)多呈梭型，立體感

4、強(qiáng)，與心肌細(xì)胞相似；western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)4周內(nèi)均可穩(wěn)定高表達(dá)Islet-1。
　　2.差速貼壁法分離培養(yǎng)的新生小鼠心肌細(xì)胞于24h已基本貼壁，可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞搏動(dòng)，頻率約為43~65次/min，72h后呈融合狀態(tài)，融合的細(xì)胞可自主同步搏動(dòng)，頻率約為50-110次/min；免疫熒光檢測(cè)約90%以上細(xì)胞可表達(dá)cTnT和CX43，可將其作為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照組。
　　3. RT-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組鈉、鉀、鈣離子通

5、道編碼基因，即scn5a（INa離子通道編碼基因）、 kcnd3（Ito離子通道編碼基因）、 kcne1（Iks離子通道編碼基因）、kcnj2（Ik1離子通道編碼基因）、cacan1c（IL-Ca離子通道編碼基因）和cacan1h（IT-Ca離子通道編碼基因）表達(dá)量均明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.05）；
　　4.全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞可表達(dá)鈉電流（INa）、瞬時(shí)外向鉀電流（Ito）、緩慢激活延遲整流鉀電

6、流（Iks）、內(nèi)向整流鉀電流（Ik1）以及T型鈣電流（IT-Ca），其中Ito、Iks在空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組也有表達(dá)，其余電流未在空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組檢出。實(shí)驗(yàn)組離子通道的峰值電流明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，呈現(xiàn)不均一性，但較心肌細(xì)胞低。
　　結(jié)論：
　　Islet-1體外誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞特異性分化為心肌細(xì)胞過(guò)程中，心肌特異鈉鉀鈣離子通道電流的相應(yīng)編碼基因表達(dá)明顯增加，且全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)成功檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞有