miR-125b在C3H10T1-2間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的表達(dá)及其靶基因分析.pdf

1、研究背景及目的:
　　微小RNA(microRNA、miRNA、miR)是一類長(zhǎng)約21-25nt的單鏈小分子RNA(single-stranded RNA,ssRNA),位于細(xì)胞染色體的非編碼區(qū),是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA,即非編碼RNA(non-codingRNA,ncRNA),通過調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝過程而發(fā)揮其生物學(xué)作用。miRNA通過與其靶mRNA分子的3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslational region,3'

2、UTR)互補(bǔ)配對(duì),抑制靶mRNA的翻譯或降解靶mRNA,從而負(fù)性調(diào)控靶基因表達(dá)。近年來(lái),越來(lái)越多的證據(jù)表明,miRNA通過下調(diào)維持干細(xì)胞未分化狀態(tài)的某些基因,同時(shí)激活干細(xì)胞譜系特異性基因,調(diào)節(jié)干細(xì)胞的定向分化,如成骨分化、成脂分化等。
　　成骨細(xì)胞是骨形成中的一類重要細(xì)胞,源于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。在MSCs向成骨細(xì)胞分化過程中存在多水平的調(diào)控機(jī)制,多種激素及旁分泌和/或自分泌細(xì)胞

3、因子被證實(shí)參與這一調(diào)節(jié)。有文獻(xiàn)報(bào)道提示miR-125b可能是骨髓MSCs向成骨細(xì)胞分化過程中的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子,但具體調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。因此,本研究旨在探明miR-125b在MSC成骨分化過程中的表達(dá)變化,明確其靶基因,初步探討miR-125b調(diào)節(jié)MSCs成骨分化的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.以miR-125b為研究對(duì)象,利用基因芯片檢測(cè)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2成骨分化過程中miRNA表達(dá)譜,以未分化細(xì)

4、胞為對(duì)照組,誘導(dǎo)成骨分化7天(第一組)、14天(第二組)為實(shí)驗(yàn)組,分析三組之間miRNA尤其是miR-125b表達(dá)差異。另外,利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)成骨分化1、3、5天后miR-125b表達(dá)結(jié)果。
　　2.為明確miR-125b作用靶點(diǎn),我們通過picTar、miRanda、Targetscan三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析,查找miR-125b的潛在靶基因,在miR-125b的眾多預(yù)測(cè)靶基因中,挑選具有成骨調(diào)節(jié)作用的核心結(jié)合

5、因子Cbfβ進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　3.為了驗(yàn)證Cbfβ3’-UTR是miR-125b作用的真正靶點(diǎn),我們將預(yù)測(cè)的Cbfβ3’-UTR靶位點(diǎn)上下游片段進(jìn)行克隆、突變后,插入PmiR-report熒光素酶表達(dá)載體中,以pRL-TK為內(nèi)參照載體。為了獲得足夠的最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果信息,根據(jù)Cbfβ3’UTR預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)序列合成了:①miR-125b完全互補(bǔ)序列(PerfectTarget,PT),②野生型結(jié)合位點(diǎn)序列(microRNA recog

6、nition element,MRE),③去掉種子結(jié)合區(qū)的突變形式結(jié)合序列(MRE-mutation,mut)。為增加效能,分別使用2×PT,2×MRE,2×mut,前期文獻(xiàn)已證實(shí)了這種質(zhì)粒構(gòu)建方式的適用性。然后將重組質(zhì)粒、對(duì)照質(zhì)粒miR-125bmimic或anti-miR-125b共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48小時(shí)后裂解細(xì)胞行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。
　　4.在C3H10T1/2細(xì)胞中過表達(dá)外源性miR-125b和干擾表達(dá)內(nèi)源性mi

7、R-125b,48小時(shí)后行Western-Blot和RT-PCR檢測(cè)Cbfβ表達(dá)量變化,觀察miR-125b對(duì)Cbfβ的調(diào)控作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.生物芯片結(jié)果顯示:①C3H10T1/2細(xì)胞誘導(dǎo)分化7天組與未分化組對(duì)比:表達(dá)量上調(diào)分子12個(gè),下調(diào)分子30個(gè);分化14天組與分化7天組對(duì)比,表達(dá)上調(diào)miRNA分子92個(gè),下調(diào)miRNA分子94個(gè);分化14天組與未分化組對(duì)比:表達(dá)量上調(diào)分子84個(gè),下調(diào)分子98個(gè)(上調(diào)以2倍

8、為下限,下調(diào)以0.5倍為上限)。②C3H10T1/2細(xì)胞誘導(dǎo)分化7天組和14天組miR-125b表達(dá)量與未分化組表達(dá)量比值分別為:未分化組/分化7天組/分化14天組=1/0.8710/0.6378.。實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果示:C3H10T1/2細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化1、3、5天后miR-125b表達(dá)量較未分化組明顯降低(P<0.05)。
　　2.生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,小鼠種系miR-125b作用靶點(diǎn)共計(jì)342個(gè),其中包括在骨形成

9、過程中具有重要作用的核心結(jié)合因子Cbfβ,CbfβmRNA的3’-UTR含有一個(gè)與miR-125b種子序列匹配的潛在結(jié)合位點(diǎn)。
　　3.重組質(zhì)粒pMIR-2×PT,pMIR-2×MRE,pMIR-2×mut經(jīng)HindⅢ單酶切,瓊脂糖凝膠電泳,可于5000-7500bp之間獲得目的條帶。送大連TAKARA公司測(cè)序,結(jié)果示堿基序列和設(shè)計(jì)序列完全一致,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果:將PmiR-2×PT與miR-125bm

10、imic或anti-miR-125b共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,熒光素酶活性有顯著減少或增加,證實(shí)了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)體系的有效性。將PmiR-2×MRE與miR-125bmimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,熒光素酶表達(dá)受到明顯抑制,而轉(zhuǎn)染PmiR-2×mut與miR-125bmimic后,熒光素酶表達(dá)無(wú)明顯變化。另外,我們發(fā)現(xiàn)將anti-miR-125b與PmiR-2×MRE、miR-125bmimic共轉(zhuǎn)染后,可中和掉miR-125bmimic對(duì)

11、PmiR-2×MRE的抑制作用;將anti-miR-125b與PmiR-2×mut、miR-125bmimic共轉(zhuǎn)染后,熒光素酶活性仍無(wú)明顯變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　4.Western-Blot和RT-PCR結(jié)果顯示:在C3H10T1/2細(xì)胞中過表達(dá)miR-125b,Cbfβ蛋白和mRNA表達(dá)量明顯降低;用轉(zhuǎn)染anti-miR-125b的方式抑制miR-125b后,Cbfβ蛋白和mRNA表達(dá)量明顯