c-Kit-Gαi-Gab1信號復合物在骨髓間充質干細胞成骨分化過程中的作用.pdf

1、背景和目的：
　　骨折愈合是一個復雜的細胞組織學修復過程，包括細胞增殖、分化遷移、和多種細胞因子的調控等，其中，干細胞因子（stem cell factor，SCF）與其受體c-Kit特異性結合后，誘導c-Kit二聚化或寡聚化，激活下游多條信號通路，包括PI3K-Akt-mTOR通路、ERK-MAPK通路等，對骨的形成和代謝有重要調節(jié)作用。但SCF/c-Kit受體對骨髓間充質干細胞（Bone Mesenchymal Stem Ce

2、lls，BMSCs）成骨分化的影響和如何激活下游PI3K-Akt-mTOR通路和ERK-MAPK通路的機制仍未完全明確。近年來，研究證實Gαi蛋白與Gab1蛋白偶聯(lián)激活酪氨酸激酶受體（Tyrosine Kinase Receptors，RTKs）下游信號通路，如：EGFR、FGFR、PDFGR等，而c-Kit受體是一種Ⅲ型RTKs受體，也可能通過Gαi蛋白介導下游信號通路。因此，本研究著重探索SCF對骨髓間充質干細胞成骨分化影響，并探討

3、 c-Kit-Gαi/Gab1復合物介導 SCF激活下游信號通路的內在機制。
　　方法：
　　(1)取對數(shù)生長期細胞，以0、50、100ng/mL SCF處理MG63、U-2OS和BMSCs細胞48小時或者14天，用MTT法和集落形成實驗檢測SCF對BMSCs和成骨細胞增殖的作用。(2)以0、100ng/mL SCF和/或1μM地塞米松處理BMSCs24小時，用流式細胞術檢測SCF抗地塞米松誘導BMSCs細胞凋亡作用。(3)

4、以Gαi-shRNA慢病毒干擾BMSCs Gαi蛋白表達后，以0、50、100ng/mLSCF或者成骨誘導劑（10-8 mol/L地塞米松、5μg/ml抗壞血酸和10mmol/Lβ磷酸甘油酸）處理BMSCs7天，用ALP染色法和ALP活性檢測試劑盒檢測BMSCs成骨分化。(4)為了探索Gαi和Gab1蛋白在SCF/c-Kit信號傳導中的作用，本研究以野生型小鼠成纖維細胞（Mouse embryonic fibroblasts，MEFs）

5、和不同基因敲除型成纖維細胞為研究對象，并應用慢病毒干擾技術阻斷野生型小鼠胚胎成纖維細胞和骨髓間充質干細胞 Gαi蛋白表達以及用脂質體作為載體向Gαi1/3雙基因敲除型MEFs導入外源性Gαi蛋白后，用Western blot檢測SCF誘導BMSCs和MEFs相關細胞Akt(Thr308和Ser473)、mTORC1、S6、GSK、Gab1、c-Kit、S6K、ERK蛋白表達及活性改變。免疫共沉淀方法檢測Gαi-Gab1復合物與c-Kit

6、受體偶聯(lián)情況。
　　結果：
　　(1)SCF促進MG63、U-2OS成骨細胞和BMSCs體外增殖和克隆形成（p<0.05）。(2)SCF抑制地塞米松誘導BMSCs凋亡作用（p<0.05）。(3)ALP染色及活性檢測結果顯示，與對照組相比，SCF增加了 ALP陽性細胞數(shù)量和 ALP活性（p<0.05），而Gαi-shRNA干擾BMSCs后，ALP陽性細胞數(shù)量和ALP活性無明顯增加（p>0.05）。(4)Western Blot

7、結果顯示，c-Kit受體表達于MG63、U-2OS成骨細胞和BMSCs，并被SCF激活。SCF誘導BMSCs和MEFs Akt-mTORC1和ERK-MAPK信號通路相關分子Akt(Thr308和Ser473)、mTORC1、S6、GSK、Gab1、S6K、ERK蛋白以及 c-Kit受體磷酸化，而基因敲除或者shRNA干擾技術阻斷Gαi1、Gαi3或Gab1蛋白表達后，SCF不能誘導BMSCs和MEFsAkt(Thr308和Ser473

8、)、mTORC1、S6、GSK、Gab1、S6K、ERK蛋白以及 c-Kit受體磷酸化。外源性導入Gαi1或Gαi3蛋白到Gαi1/3雙基因敲除型MEFs（DKO）細胞后，SCF能誘導MEFsAkt(Thr308和Ser473)、mTORC1、S6、GSK、Gab1、S6K、ERK蛋白以及 c-Kit受體磷酸化。免疫共沉淀結果顯示在BMSCs和MEFs中，Gαi/Gab1復合物均能與c-Kit受體發(fā)生偶聯(lián)。
　　結論：