Pcp4基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外骨向分化過程中的表達(dá).pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone malTOW mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潛能，在特定條件下可以向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、成肌細(xì)胞等多種細(xì)胞分化，是組織工程研究中常用的種子細(xì)胞。迄今為止，觸發(fā)和控制BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化的基因機制仍未明晾。本研究目的在于建立大鼠BMSCs的分離、純化、培養(yǎng)及體外骨向分化誘導(dǎo)體系，應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化的差異表達(dá)基因，并采用實時

2、熒光定量PCR(real．time fluorescence quantitmive PCR，RQ-PCR)技術(shù)在細(xì)胞學(xué)水平上定量檢測篩選出的基因在BMSCs骨向分化過程中表達(dá)量的變化，分析其變化趨勢，為深入了解BMSCs骨向分化的分子調(diào)控機制和功能學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。 本研究采用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化BMSCs，進(jìn)行原代培養(yǎng)，當(dāng)貼壁細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底約80％時傳代，將第三代的BMSCs加入骨向誘導(dǎo)液行骨向誘導(dǎo)，通過觀察細(xì)

3、胞形態(tài)、描繪細(xì)胞生長曲線、計算細(xì)胞倍增時間、定量檢測堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色、茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色等對未誘導(dǎo)和骨向誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。在上述實驗的基礎(chǔ)上，在相同的培養(yǎng)條件下，取第三代的BMSCs行骨向誘導(dǎo)，骨向誘導(dǎo)后14天的細(xì)胞作為實驗組，未誘導(dǎo)的0天細(xì)胞作為對照組，提取0天和骨向誘導(dǎo)后14天的細(xì)胞的RNA，應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化的差異表達(dá)基因。在相同條件下，同樣取第三代的BM

4、SCs，將行骨向誘導(dǎo)的BMSCs作為實驗組，未誘導(dǎo)的0天細(xì)胞作為對照組，分別提取0天和骨向誘導(dǎo)后4天、1周、2周和3周5個不同時相細(xì)胞的RNA，對細(xì)胞的總RNA質(zhì)量和RT-PCR．(reversetranscription polymerase chain reaction，RT-PCR)產(chǎn)物等進(jìn)行質(zhì)控分析，采用實時熒光定量PCR技術(shù)對篩選出的差異表達(dá)基因在BMSCs骨向分化過程中的表達(dá)量變化進(jìn)行連續(xù)性研究，分析其變化趨勢，并利用生物信

5、息學(xué)方法對其與成骨相關(guān)的功能進(jìn)行初步探討。 研究結(jié)果顯示采用的密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得了純度高的BMSCs，用含β-甘油磷酸鈉、地塞米松、左旋抗壞血酸和維生素D3的骨向誘導(dǎo)液對第三代的BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)BMSCs骨向分化。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基和原代培養(yǎng)基對細(xì)胞生長的影響無明顯差異，原代培養(yǎng)基培養(yǎng)的BMSCs的倍增時間為30小時，骨向誘導(dǎo)后其倍增時間為40小時；BMSCs經(jīng)過骨向誘導(dǎo)后，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出典型的成

6、骨細(xì)胞改變；加入誘導(dǎo)液培養(yǎng)的BMSCs堿性磷酸酶活性明顯增加，而未誘導(dǎo)細(xì)胞的堿性磷酸酶活性仍保持較低水平，無明顯變化；骨向誘導(dǎo)1周后，細(xì)胞I型膠原免疫化學(xué)染色呈陽性反應(yīng)；BMSCs經(jīng)骨向誘導(dǎo)后2周可見明顯的礦化結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色表現(xiàn)為細(xì)胞間片狀紅染的類圓形的致密不透光團(tuán)塊。應(yīng)用基因芯片技術(shù)成功篩選出BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化的差異表達(dá)基因浦肯野細(xì)胞蛋白4(Purkinje cell protein 4，Pcp4)基因。實時熒光定量P

7、CR結(jié)果表明，在：BMSCs向成骨細(xì)胞分化過程的5個時段，Pcp4基因的表達(dá)量呈上升趨勢，其中Pcp4基因在第7天時的表達(dá)量比第0天的對照組升高了7倍，在第14天時的表達(dá)量比第0天的對照組升高了9倍，在第21天時的表達(dá)量比第0天的對照組升高了6倍，其表達(dá)量的峰值在第14天，與應(yīng)用基因芯片技術(shù)的檢測結(jié)果完全符合，說明在BMSCs向成骨細(xì)胞分化的過程中，Pcp4為上調(diào)表達(dá)基因。通過結(jié)合生物信息學(xué)方法分析，我們作出了如下推測：礦化結(jié)節(jié)的形成是

8、成骨能力的可靠指標(biāo)，Pcp4有調(diào)節(jié)Ca<'2+>結(jié)合動力學(xué)的能力，可能參與促進(jìn)鈣鹽的沉積、形成礦化結(jié)節(jié)；在BMSCs骨向分化的過程中，蛋白激酶路徑的激活是BMPs活化信號的關(guān)鍵，而Pcp4與CaM依賴性蛋白激酶的激活有關(guān)，參與了PKA的調(diào)控，而且Pcp4有突觸傳遞功能，因此認(rèn)為Pcp4可能與BMPs之間存在某種信號傳導(dǎo)關(guān)系。Pcp4基因與成骨有關(guān)的具體功能值得深入研究。 綜上所述，本研究采用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化大鼠

9、BMSCs，獲得了高純度的BMSCs，采用骨向誘導(dǎo)液成功誘導(dǎo)BMSCs成骨定向分化。應(yīng)用基因芯片技術(shù)首次成功篩選出BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化的差異表達(dá)基因Pcp4基因。采用實時熒光定量。PCR技術(shù)，對應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選出的BMSCs骨向分化過程中的差異表達(dá)基因Pcp4在不同時相的表達(dá)量進(jìn)行連續(xù)性研究，結(jié)果表明在BMSCs向成骨細(xì)胞分化的5個時段，Pcp4基因的表達(dá)量呈上升趨勢，其表達(dá)量的峰值在第14天。表明Pcp4基因介導(dǎo)了BMSC