Akt在Islet-1促C3H10T1-2向心肌樣細(xì)胞特化過程中的作用探討.pdf

1、目的：
　　用攜帶Islet-1的慢病毒感染間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2并誘導(dǎo)其向心肌細(xì)胞特異分化。在此條件下，通過影響Akt的活性，檢測心肌早期發(fā)育相關(guān)基因的變化情況，來探討Akt在此特化過程中是否發(fā)揮促分化的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　1.取生長狀態(tài)以及形態(tài)良好的間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2以5×104個/T13的密度進(jìn)行細(xì)胞鋪瓶，待增殖融合度達(dá)到60-70﹪時，向瓶中添加帶有GFP和Islet-1的慢病毒感

2、染細(xì)胞。待慢病毒感染細(xì)胞特定時間后，利用流式細(xì)胞術(shù)對感染細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測；細(xì)胞免疫熒光對Islet-1，cTnT和p-Akt/T-Akt蛋白的定位和表達(dá)進(jìn)行檢測以及采用Western-bloting對這些蛋白進(jìn)行半定量測定。
　　2.Akt特異性抑制劑 MK-2206處理 Islet-1慢病毒感染后的細(xì)胞,CCK-8法檢測其對病毒感染后細(xì)胞增殖的影響以及采用Western-bloting對細(xì)胞Akt活性進(jìn)行檢測；實(shí)時熒光

3、定量PCR對各組細(xì)胞心肌特異轉(zhuǎn)錄因子（Mef2c,Nkx2.5和GATA4）的mRNA時序性表達(dá)情況進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)慢病毒感染的C3H10T1/2細(xì)胞培養(yǎng)96h后，可在鏡下觀察到穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞約為90％，F(xiàn)CM對陰性和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)染效率的檢測結(jié)果分別為89.7％和94.7％。免疫熒光和Western-bloting均檢測到感染后細(xì)胞Islet-1和cTnT蛋白的表達(dá)。
　　2.CCK-8結(jié)果

4、表明，MK-2206的濃度與其對細(xì)胞的生長抑制程度呈正相關(guān)；Western-bloting結(jié)果顯示，其對感染后細(xì)胞Akt活性的最佳抑制濃度為8nmol/L；隨著誘導(dǎo)分化時間的延長，感染后細(xì)胞的p-Akt/T-Akt蛋白表達(dá)逐漸降低，且在第3周最低（*P＜0.05），而后開始升高；Q-PCR檢測到心肌特異基因Mef2c,Nkx2.5和GATA4的mRNA表達(dá)量出現(xiàn)逐漸升高的趨勢（*P＜0.05），說明干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞特異分化；經(jīng)MK-2