Islet-1促M(fèi)SCs向心肌樣細(xì)胞分化中甲基化-乙?；换プ饔脵C(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　明確在 Islet-1誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells， MSCs）向心肌樣細(xì)胞分化過(guò)程中組蛋白甲基化/乙酰化和DNA甲基化修飾在調(diào)控心肌早期轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)中的作用，鑒定出三種修飾參與調(diào)控這些因子的關(guān)鍵酶，并初步探明這些關(guān)鍵酶在調(diào)控心肌早期轉(zhuǎn)錄因子過(guò)程中交互作用的機(jī)制。為提高 MSCs向心肌細(xì)胞的分化率以更好地應(yīng)用于臨床治療心血管疾病打下重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.染

2、色質(zhì)免疫共沉淀（ Chromatin immunoprecipitation qPCR， ChIP-qPCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)染GATA4和Nkx2.5啟動(dòng)子區(qū)組蛋白乙?；?甲基化水平，以及三種修飾的關(guān)鍵酶與這些區(qū)域的結(jié)合情況
　　2.甲基化特異性PCR（Methylation-Specific PCR，MSP）用以初步檢測(cè)GATA4和Nkx2.5啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化水平
　　3.亞硫酸鹽測(cè)序（bisulfite sequencin

3、g PCR，BSP）對(duì)MSP中DNA甲基化水平變化明顯的樣本進(jìn)行驗(yàn)證
　　4.熒光定量PCR（fluorescence quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）檢測(cè)GATA4和Nkx2.5的mRNA表達(dá)水平
　　5. Western blot檢測(cè)組蛋白甲基化/乙?；虳NA甲基化修飾各自發(fā)揮作用的關(guān)鍵酶表達(dá)情況、
　　6.免疫熒光檢測(cè)心肌特異蛋白 cTnT和縫隙連接蛋白 Cx43的表達(dá)，以驗(yàn)證MSCs是否向心肌

4、樣細(xì)胞分化
　　結(jié)果：
　　1.在Islet-1誘導(dǎo)的分化過(guò)程中，GATA4啟動(dòng)子區(qū)第二位點(diǎn)組蛋白乙酰化水平逐漸升高，而組蛋白甲基化和DNA甲基化水平逐漸降低；Nkx2.5啟動(dòng)子區(qū)組蛋白乙酰化/甲基化水平與其在GATA4啟動(dòng)子區(qū)的趨勢(shì)一致，但DNA甲基化水平在整個(gè)分化過(guò)程中沒(méi)有改變
　　2. Islet-1誘導(dǎo)同時(shí)用5-aza改變DNA甲基化水平，可以引起GATA4啟動(dòng)子區(qū)第二位點(diǎn)組蛋白乙?；吆徒M蛋白甲基化水平降低

5、，但是無(wú)法改變Nkx2.5啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白乙?；?甲基化水平
　　3. Islet-1誘導(dǎo)同時(shí)用TSA改變組蛋白乙?；?，GATA4啟動(dòng)子區(qū)第二位點(diǎn)的組蛋白甲基化水平和 DNA甲基化水平都明顯降低，而Nkx2.5啟動(dòng)子區(qū)僅表現(xiàn)出組蛋白甲基化水平降低
　　4. Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Islet-1誘導(dǎo)分化過(guò)程中三種表觀遺傳修飾的關(guān)鍵酶有明顯變化的有 Gcn5、P300、HDAC1、G9A、DNMT-1和DNMT-3

6、a
　　5. ChIP-qPCR檢測(cè)出與GATA4和Nkx2.5啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的關(guān)鍵酶主要有Gcn5、HDAC1、G9A、DNMT-1，另外HP1-α和HP1-β也結(jié)合在這些區(qū)域；DNMT-1、HP1-α和HP1-β雖然與Nkx2.5有結(jié)合，但在整個(gè)分化過(guò)程中結(jié)合水平并沒(méi)有變化
　　6.與Islet-1誘導(dǎo)組相比抑制Gcn5后GATA4和Nkx2.5的表達(dá)水平明顯降低，且沒(méi)有出現(xiàn)cTnT和Cx43的表達(dá)，表明抑制Gcn5能夠阻

7、止MSCs向心肌樣細(xì)胞分化
　　7.抑制Gcn5后，與Islet-1誘導(dǎo)組相比HDAC1、G9A、HP1-α、HP1-β和DNMT-1與GATA4啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合都明顯升高，且該區(qū)域的組蛋白乙酰化水平顯著降低，組蛋白甲基化和DNA甲基化水平明顯升高；而HP1-α、HP1-β和DNMT-1與Nkx2.5的結(jié)合沒(méi)有受到Gcn5被抑制的影響，因而DNA甲基化水平與Islet-1誘導(dǎo)組相比沒(méi)有明顯改變
　　結(jié)論：
　　Islet