BMP-2誘導(dǎo)骨髓源性心肌干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過(guò)程中形態(tài)和電生理變化及Smad信號(hào)通路的調(diào)控作用.pdf

1、目的：研究BMP．2誘導(dǎo)MCSCs向心肌細(xì)胞分化中細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和電生理特征變化，明確Smad信號(hào)通路在BMP．2誘導(dǎo)的MCSCs向心肌細(xì)胞分化中的調(diào)控作用，探討MCSCs向心肌細(xì)胞分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法：從SD大鼠骨髓中分離MMSC，通過(guò)單克隆培養(yǎng)技術(shù)、c-kit免疫熒光標(biāo)記和用RT-PCR檢測(cè)心肌早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5的表達(dá)，從MMSC中篩選出具有心肌特異分化潛能的MCSCs。用BMP-2誘導(dǎo)MCSCs向心肌細(xì)胞定向分

2、化。在MCSCs分化過(guò)程中，用相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞心肌特異性蛋白cTnT的表達(dá)，用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄細(xì)胞的AP和ICa-L。采用westemblot和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷酸化Smadl／5／8的表達(dá)及其分布特點(diǎn)的變化。用RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞的GATA-4和cTnTmRNA表達(dá)變化。用Smad信號(hào)抑制劑SB203580處理細(xì)胞后，觀察對(duì)磷酸化Smadl／5／8表達(dá)及其分布和對(duì)GATA-4和cT

3、nTmRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果：從MMSC克隆中篩選出表達(dá)Nkx2.5的c-kit+MMSC克隆，即MCSCs。用BMP．2誘導(dǎo)后，細(xì)胞的形態(tài)和排列方式發(fā)生明顯變化。誘導(dǎo)后4周，可見(jiàn)多個(gè)細(xì)胞相互連接形成肌管樣結(jié)構(gòu)。MCSCs不表達(dá)cTnT，誘導(dǎo)后2周開(kāi)始表達(dá)，3～4周表達(dá)增強(qiáng)，呈現(xiàn)密集的橫紋樣結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)后3周，可記錄到具有心室肌細(xì)胞特點(diǎn)的AP，但平臺(tái)期不明顯。4周細(xì)胞的AP出現(xiàn)明顯的平臺(tái)期，類(lèi)似于成年大鼠心室肌細(xì)胞的AP。誘導(dǎo)后

4、3周可記錄到ICa-L,但電流值較小。4周細(xì)胞ICa-L的電流值增大，激活電位為-40mv，最大激活電位為0mV，反轉(zhuǎn)電位為+60mV，與成年大鼠心室肌細(xì)胞的ICa-L相似。BMP一2誘導(dǎo)后15min，細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到磷酸化Smad1／5／8的表達(dá)，30min和1h表達(dá)明顯增加，1h后開(kāi)始降低，4h呈低表達(dá)。l5min時(shí)磷酸化的Sm甜1／5／8僅見(jiàn)于胞質(zhì)中，30min時(shí)胞質(zhì)和胞核均見(jiàn)表達(dá)，1h主要在胞核內(nèi)表達(dá)。誘導(dǎo)后2周，細(xì)胞明顯表達(dá)GA

5、TA-4和cTnTmRNA，4周的細(xì)胞GAIA-4和cTnTmRNA表達(dá)增強(qiáng)。抑制Smad信號(hào)后，磷酸化Smadl／5／8的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞核內(nèi)未見(jiàn)明顯表達(dá)，GATA-4和cTnTmRNA的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞的形態(tài)未見(jiàn)明顯變化。 結(jié)論：骨髓中含有具有心肌特異性分化潛能的MCSCs，BMP．2能夠誘導(dǎo)MCSCs向心肌細(xì)胞分化，分化后的細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)和電生理方面具備了功能性心肌細(xì)胞的特征。Smad信號(hào)通路在BMP一2誘導(dǎo)MCSCs