AREG-EGFR信號軸介導(dǎo)胰腺癌EMT效應(yīng)及相關(guān)機制的研究與人胰腺星形細胞永生化建系.pdf

1、由于大部分胰腺癌患者被確診時疾病已經(jīng)發(fā)展至進展期，因而喪失了通過手術(shù)完全切除腫瘤的機會。加之胰腺癌對于放療、化療治療的敏感性有限。使得尋找有關(guān)胰腺癌診斷、治療及判斷患者預(yù)后的新標(biāo)志物意義重大。胰腺星形細胞(PSC)與胰腺癌細胞的相互作用是胰腺癌發(fā)病機制研究的熱點，這兩種細胞間的相互作用能更真實地模擬胰腺癌復(fù)雜的微環(huán)境。
　　目的:
　　第一部分 對AREG/EGFR在胰腺癌中的表達及其作用進行探討。
　　(1)對EGF

2、R、EGFRvⅢ和AREG在胰腺癌組織中的表達情況及其與病人的臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性進行研究;
　　(2)對AREG/EGFR信號軸介導(dǎo)胰腺癌EMT效應(yīng)及相關(guān)機制進行研究。
　　第二部分 對人胰腺星形細胞進行永生化建系處理，為后期繼續(xù)研究AREG在PSC中所起的作用提供實驗材料基礎(chǔ)。
　　方法：
　　第一部分
　　(1)首先，采用免疫組織化學(xué)染色對92例胰腺導(dǎo)管腺癌組織進行EGFR、EGFRvⅢ和ARE

3、G表達檢測，通過卡方檢驗判斷EGFR、EGFRvⅢ、AREG及AREG/EGFR共表達情況與胰腺癌臨床特征的關(guān)系，利用Pearson檢驗對AREG表達和EGFR表達之間進行相關(guān)性分析;制作Kaplan-Meier生存曲線，通過log-rank檢驗比較高表達/低表達組間的生存差異，最后利用COX回歸進行多因素分析。
　　(2)利用RNA干擾技術(shù)和重組蛋白研究AREG對胰腺癌細胞系自身侵襲和遷移能力的影響。采用細胞劃痕實驗，細胞遷移實

4、驗和細胞侵襲實驗驗證細胞運動能力，使用MMP/TIMP蛋白質(zhì)芯片篩選AREG對胰腺癌MMP/TIMP蛋白質(zhì)表達的影響，利用Western blot驗證AREG/EGFR對胰腺癌細胞系EMT蛋白及轉(zhuǎn)錄因子的表達的影響，使用EGFR、MEK1/2和NF-κB抑制劑驗證AREG/EGFR活化下游信號通路改變情況。同時，驗證AREG在4例原代培養(yǎng)PSC中的表達情況，研究PSC對胰腺癌細胞侵襲和遷移能力的影響。
　　第二部分 建立人胰腺星形

5、細胞永生化細胞系。
　　使用重組慢病毒將SV40LT抗原基因和hTERT基因?qū)朐鷋PSC，經(jīng)過嘌呤霉素抗性篩選及擴大培養(yǎng)。通過光學(xué)顯微鏡、免疫組化、染色體核型分析、生長曲線測定、裸鼠成瘤實驗等研究其生物學(xué)特性。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　(1)在胰腺癌組織中，EGFR陽性表達率為46.7％(43/92)，EGFRvⅢ陽性表達率為13％(12/92)，AREG陽性表達率為53.3％(49/92)。EGFR和

6、EGFRvⅢ陽性表達部位為細胞膜及細胞漿，AREG陽性表達部位為細胞漿;EGFR表達與腫瘤的分化程度相關(guān)，AREG/EGFR共表達與腫瘤的分化程度相關(guān);AREG表達和EGFR表達之間無相關(guān)性(Φ=0.039，P=0.709);單因素生存分析結(jié)果顯示，AREG表達(P=0.021，P=0.003)、TNM分期(P=0.003，P=0.001)和腫瘤分化程度(P=0.009，P=0.002)是胰腺癌患者DFS和OS預(yù)后不良的有關(guān)因素。多因素

7、分析結(jié)果顯示腫瘤分化程度(DFSHR=1.785，P=0.021; OS HR=2.125，P=0.004)是胰腺癌患者預(yù)后DFS和OS預(yù)后不良的獨立影響因素。此外，AREG表達(HR=1.822，P=0.03)、TNM分期(HR=2.25，P=0.03)和手術(shù)切緣狀態(tài)(HR=1.84，P=0.045)是胰腺癌患者OS預(yù)后不良的獨立影響因素。
　　(2)細胞劃痕實驗，細胞遷移能力實驗和細胞體外侵襲實驗結(jié)果顯示:敲低AsPC-1細胞

8、AREG表達能顯著下調(diào)腫瘤細胞的遷移、侵襲能力。Western blot及IF結(jié)果顯示，敲低AREG表達使AsPC-1細胞EMT相關(guān)蛋白表達水平發(fā)生改變，包括E-cadherin和ZO-1表達水平上升，Vimentin及β-catenin的表達水平下降，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和ZEB1的表達水平水平下調(diào);MMP/TIMP蛋白芯片結(jié)果顯示，AREG對胰腺癌多種MMP/TIMP蛋白質(zhì)表達有影響，其中對MMP-9影響最顯著。同

9、時，AREG受體EGFR的磷酸化水平顯著下調(diào);敲低AREG表達能拮抗AREG/EGFR信號軸對ERK、AKT和STAT3等多條信號通路活化作用。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB入核水平顯著下降。上調(diào)AREG表達能夠增強PANC-1細胞的遷移、侵襲能力。外源性升高AREG表達使PANC-1細胞E-Cadherin和ZO-1蛋白表達水平下調(diào)，Vimentin，β-catenin和MMP-9的蛋白表達水平上調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug表達增強，而ZEB

10、1表達改變不明顯;同時PANC-1細胞，AREG/EGFR信號軸可以活化ERK、AKT和STAT3信號通路，其中對ERK和AKT磷酸化水平的影響最為明顯，同時能夠增加PANC-1細胞NF-κB的轉(zhuǎn)錄入核水平，這種增強效應(yīng)能夠分別被PD153035和/或U1026減弱。AREG/EGFR信號軸對胰腺癌細胞遷移、侵襲和EMT效應(yīng)的上調(diào)作用能夠被QZN拮抗。AREG在4例原代培養(yǎng)PSC中可均見不同程度表達，PSC能顯著增強胰腺癌細胞遷移和侵襲

11、能力，這種對胰腺癌細胞的趨化效應(yīng)不能被AREG中和抗體所拮抗。
　　第二部分 采用outgrowth法培養(yǎng)原代PSC，原代PSC經(jīng)過SV40LT和hTERT重組慢病毒感染，嘌呤霉素連續(xù)篩選獲得高表達SV40LT基因和hTERT基因的hPSC細胞株im PSC; RT-qPCR及Western blot結(jié)果顯示im PSC細胞SV40LT和hTERT RNA和蛋白質(zhì)表達水平高;IHC結(jié)果im PSCα-SMA和VIM染色陽性，胞漿內(nèi)

12、見棕黃色顆粒，im PSC呈典型PSC活化狀態(tài);此外，可見有極少部分細胞GFAP弱陽性表達;染色體核型分析可見，im PSC染色體總數(shù)發(fā)生改變，眾數(shù)為60條;細胞生長曲線顯示:im PSC組細胞呈現(xiàn)典型“S”形生長曲線;裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示，im PSC細胞在裸鼠體無成瘤性。
　　結(jié)論：
　　AREG表達是胰腺癌患者OS預(yù)后不良的獨立影響因素。AREG/EGFR信號軸能夠促進胰腺癌細胞的遷移、侵襲和EMT效應(yīng)。其機制可能為:

13、AREG通過和受體EGFR相互結(jié)合，激活EGFR胞內(nèi)區(qū)(pY1068)磷酸化，通過AREG/EGFR信號軸活化胰腺癌細胞內(nèi)ERK、AKT和STAT3信號通路，上調(diào)NF-κB入核水平，繼而使EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail及Slug表達水平上調(diào)，抑制E-cadherin表達，并促使Vimentin和MMP-9表達，使胰腺癌細胞發(fā)生EMT。AREG/EGFR信號軸可能是治療胰腺癌的潛在靶點，抑制該信號軸的激活在體外實驗中能有效抑制胰腺癌的侵襲和