胰腺癌中Hedgehog信號(hào)通路調(diào)控RegIV的相關(guān)研究.pdf

1、胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是惡性程度很高的腫瘤，其在致死率居腫瘤的第四位，男性中的發(fā)病率為3.1～20.8/10萬，女性為2～11/10萬。在過去的40年中，PC的發(fā)病率增加了三倍。胰腺癌的中位數(shù)生存時(shí)間少于6個(gè)月，5年生存率為3％～5％，其死亡率幾乎等同于發(fā)病率。和其他腫瘤一樣，其病因迄今尚未明確。但是對(duì)其發(fā)病的危險(xiǎn)因素已有較深入的研究，其危險(xiǎn)因素包括吸煙、飲食因素、慢性胰腺炎、糖尿病等，胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中

2、存在多種基因的突變，包括K-ras、INK4A、p53和SMAD4/DPC4等。臨床上，30％的胰腺癌患者在診斷時(shí)已是中晚期，50％的患者已經(jīng)發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，總體上接近80％的胰腺癌患者在診斷時(shí)已無手術(shù)指征，早期診斷困難、早期發(fā)生轉(zhuǎn)移是胰腺癌死亡率高的主要原因。因此，闡明胰腺癌發(fā)病的分子機(jī)制是早期診斷并提高生存率的重要手段，也是目前研究胰腺癌的主要內(nèi)容和研究方向。
　　 Hedgehog信號(hào)通路是生物體內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，是主要

3、的調(diào)節(jié)昆蟲和哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的經(jīng)典通路之一。Hh信號(hào)通路在胰腺胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用，其存胰腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，存胰腺形成模式、生長過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞分化以及器官的形成，在原腸胚階段，Hh信號(hào)通路配體Shh表達(dá)消失是胰腺器官特化的必要條件。在包括胰腺癌在內(nèi)的多種腫瘤中Hh信號(hào)通路呈現(xiàn)異常激活，在胰腺癌細(xì)胞株、胰腺癌組織以及胰腺上皮內(nèi)瘤變中均有Hh信號(hào)通路的異常激活，可見Hh信號(hào)通路的活化是胰腺癌發(fā)生過程中重要的早期事件。Hh信號(hào)通路的活

4、化導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子GLIs進(jìn)入細(xì)胞核與其下游基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致最終的核轉(zhuǎn)錄因子Glis與下游基因啟動(dòng)子區(qū)處于結(jié)合狀態(tài)，調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，包括GLI1、PTCH、HHIP、CCND、Snail、Bcl-2、cyclinD2、FOX-F1、-L1、-M1、Follistatin和N-Myc等，使胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)上皮間質(zhì)化(EMT)的發(fā)生，并與胰腺癌干細(xì)胞形成有關(guān)，而K-ras突變也部分是通

5、過HH信號(hào)通路的激活實(shí)現(xiàn)，最終導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生。即Sonic Hedgehog-GLI1通路異常激活直接參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。
　　 再生基因家族是一類小分子的分泌性蛋白，在多種消化系腫瘤中高表達(dá)，做為生長因子或抗凋亡因子參與消化系統(tǒng)細(xì)胞的增殖和分化。再生基因家族中最短小的 RegⅣ基因參與胃腸道細(xì)胞的增殖分化，并同消化系腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移和抗藥性有關(guān)。RegⅣ在PC細(xì)胞及胰腺癌患者血清中高表達(dá)，在胰腺癌細(xì)胞中干擾RegⅣ的表

6、達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡，RegⅣ的促生長效應(yīng)可能通過PKB/Akt信號(hào)通路來介導(dǎo)，而若在培養(yǎng)基中加入重組RegⅣ會(huì)促進(jìn)細(xì)胞呈劑量依賴性生長，RegⅣ可作為PC的早期標(biāo)志，RegⅣ的單克隆抗體可能作為治療PC的新手段。過表達(dá)RegⅣ的胰腺癌細(xì)胞呈現(xiàn)抵抗γ射線但中度抵抗化療效果。在胰腺癌組織和PanIN3標(biāo)本中均發(fā)現(xiàn)RegⅣ的基因拷貝數(shù)增加，高表達(dá)RegⅣ可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖，且呈現(xiàn)抵抗吉西他濱治療。RegⅣ抗體以自分泌/旁分泌的形式影響Re

7、gⅣ，并影響腫瘤的進(jìn)展，予以RegⅣ抗體治療后導(dǎo)致瘤體內(nèi)pAkt、Bcl-xL、Bcl-2、survivin和cyclin D1水平明顯降低。在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中，GLI1和RegⅣ基因的功能有許多類似之處，是否兩者之間存在某些潛在的必然聯(lián)系使得我們進(jìn)行如下課題。
　　 要全面深入地研究Hh信號(hào)通路在胰腺癌發(fā)生中的作用機(jī)制毫無疑問需要篩選轉(zhuǎn)錄因子GLIs的靶基因。我們?cè)诒菊n題中研究了GLI1和RegⅣ基因在胰腺癌組織、胰腺癌細(xì)

8、胞株中的表達(dá)，并分析兩者表達(dá)量之間的相關(guān)性，通過構(gòu)建慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)以及慢病毒過表達(dá)基因技術(shù)，對(duì)胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行下調(diào)及上調(diào)GLI1基因，了解RegⅣ基因的表達(dá)變化情況，分析RegⅣ的啟動(dòng)子區(qū)域中是否存在潛在的GLI1結(jié)合位點(diǎn)，行CHIP實(shí)驗(yàn)、EMSA實(shí)驗(yàn)在體外證實(shí)GLI1同RegⅣ的啟動(dòng)子特定區(qū)域結(jié)合情況，對(duì)GLI1是否調(diào)控RegⅣ基因做了初步的研究。
　　 首先，研究了GLI1和RegⅣ基因在胰腺癌組織標(biāo)本、鄰近癌旁

9、組織及胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)。體外培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞株Aspc-1、BxPC-3、Capan-2、PANC-1、SW-1990，并收集臨床胰腺癌手術(shù)標(biāo)本。提取細(xì)胞株和組織總RNA，用RT-PCR法及Real-time PCR法擴(kuò)增GLI1和RegⅣ基因。結(jié)果顯示在各種細(xì)胞株、胰腺癌組織及鄰近癌旁組織中GLI1和RegⅣ均有不同程度表達(dá)。胰腺癌組織中GLI1和RegⅣ基因的表達(dá)也顯著高于鄰近癌旁組織；免疫組化及Western-blot方法也證實(shí)

10、胰腺癌組織中GLI1和RegⅣ蛋白表達(dá)明顯高于鄰近癌旁組織，并且GLI1和RegⅣ兩者之間的表達(dá)呈現(xiàn)明顯相關(guān)性。
　　 為證實(shí)GLI1和RegⅣ基因表達(dá)之間是否存在相關(guān)性，我們成功構(gòu)建了GLI1的RNA干擾慢病毒載體，將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)入GLI1表達(dá)最高的PANC-1胰腺癌細(xì)胞中，進(jìn)而檢測(cè)RegⅣ基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)的變化情況。結(jié)果證實(shí)RegⅣ基因隨著GLI1基因的下調(diào)同步下調(diào)。為進(jìn)一步GLI1和RegⅣ基因表達(dá)之間的相關(guān)性，我們

11、構(gòu)建了GLI1過表達(dá)慢病毒載體，將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)入GLI1表達(dá)最低的BxPC-3胰腺癌細(xì)胞中，進(jìn)而檢測(cè)RegⅣ基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)的變化情況，同樣也證實(shí)RegⅣ基因隨著GLI1基因的上調(diào)而同步上調(diào)。
　　 我們還進(jìn)一步分析了RegⅣ基因的啟動(dòng)子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)在-1000～+299處有5個(gè)潛在的GLI1結(jié)合位點(diǎn)，分別位于-849～-841(TACAACCTA，site1)、-759～-751(AAACACCTA，site2)、-577

12、～569(GAAAACCCG，site3)、-528～-520(GATCATCCA，site4)、-1～7(GACCACTGG，site5)，其和GLI1保守結(jié)合區(qū)域的差異性分別為67％、67％、67％、78％、67％，提示GLI1轉(zhuǎn)錄調(diào)控RegⅣ基因的表達(dá)。ChIP實(shí)驗(yàn)提示GLI1同RegⅣ啟動(dòng)子區(qū)域site4結(jié)合，轉(zhuǎn)錄調(diào)控RegⅣ基因。為進(jìn)一步證實(shí)GLI1對(duì)RegⅣ基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)系，我們進(jìn)行電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(Electrophore