低氧誘導(dǎo)胰腺癌免疫逃避機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路的初步研究.pdf

1、目的：胰腺癌是臨床上常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，手術(shù)為其最佳治療方法。然而，手術(shù)切除率低，對(duì)化療藥物普遍耐藥，復(fù)發(fā)率高導(dǎo)致胰腺癌預(yù)后極差，尋找新的治療方法成為目前研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)首先驗(yàn)證胰腺癌腫瘤內(nèi)的低氧微環(huán)境及其與MIC表達(dá)的相關(guān)性，接著在體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建低氧模型并研究低氧環(huán)境中胰腺癌細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制。同時(shí)我們?cè)诩?xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中和裸鼠成瘤模型中通過(guò)直接激活NO-cGMP-PKG信號(hào)通路來(lái)研究其對(duì)低氧誘導(dǎo)下胰腺癌細(xì)胞逃避自然殺傷作用的逆

2、轉(zhuǎn)效果，為臨床上應(yīng)用激活NO-cGMP-PKG信號(hào)通路的手段促進(jìn)先天性免疫系統(tǒng)抑制胰腺癌的發(fā)展提供理論上的依據(jù)和新的線索。
　　 方法：第一部分：收集湘雅醫(yī)院2002年1月至2008年5月手術(shù)切除的胰腺癌組織標(biāo)本42例，慢性胰腺炎組織標(biāo)本9例，8例正常胰腺組織來(lái)自移植中心提供或尸檢。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HIF-1α和MIC在胰腺癌標(biāo)本、慢性胰腺炎標(biāo)本和正常胰腺標(biāo)本中的表達(dá)情況，分析兩者之間的相關(guān)性。第二部分：構(gòu)建低氧培養(yǎng)模型，體外

3、常氧及低氧條件下培養(yǎng)胰腺癌PANC-1細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)法和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞膜上MIC的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)檢測(cè)PANC-1細(xì)胞中MIC A和MIC B的mRNA表達(dá)變化。分選、純化、擴(kuò)增人外周血NK細(xì)胞，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)不同氧濃度及NO-cGMP-PKG信號(hào)通路激活或抑制時(shí)對(duì)PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)基中可溶性MIC A和可溶性MIC B的表達(dá)影響，同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)PANC-1細(xì)胞膜上的MIC表達(dá)和PANC-1培養(yǎng)基與自然

4、殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)后NK細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)。MTT法檢測(cè)不同靶效比時(shí)NK細(xì)胞對(duì)不同氧濃度培養(yǎng)及NO-cGMP-PKG信號(hào)通路激活或抑制時(shí)PANC-1細(xì)胞的殺傷活性。第三部分：PANC-1細(xì)胞裸鼠皮下成瘤，隨機(jī)分成治療組與安慰劑組，硝酸甘油為治療藥物。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)兩組腫瘤標(biāo)本中HIF-1α和MIC的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)檢測(cè)兩組腫瘤標(biāo)本中中MIC A和MIC B mRNA表達(dá)變化。蛋白印記法檢測(cè)兩組腫瘤標(biāo)本中的MIC表達(dá)差異。酶

5、聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)兩組成瘤裸鼠及正常裸鼠血清中的可溶性MIC A及可溶性MIC B差異。流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組成瘤裸鼠及正常裸鼠血液中NK細(xì)胞上NKG2D的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：1.免疫組化示胰腺癌組織中HIF-1α蛋白和MIC蛋白陽(yáng)性率分別為為32/42(76.2％)、38/42(90.5％)，明顯高于慢性胰腺炎組織2/9(22.2％)、2/9(22.2％)和正常胰腺組織0/8(0％)、1/8(12.5％)(P<0.001)。Ⅰ-

6、Ⅱ期標(biāo)本中，HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率為57.1％，低于Ⅲ-Ⅳ期標(biāo)本中的92.9％(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為91.3％，高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的57.9％(P<0.05)。在不同病理分級(jí)和臨床分期的標(biāo)本中，MIC蛋白的表達(dá)高低也有顯著差異(P<0.05)。MIC蛋白和HIF-1α蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.522，P<0.001)。2.經(jīng)MACS免疫磁珠分選后(CD3-CD56+)NK細(xì)胞含量由分選前的

7、13.8±2.6％提高到92.1±3.7％，IL-2擴(kuò)增后滿足實(shí)驗(yàn)要求。三氣培養(yǎng)箱成功構(gòu)建了低氧培養(yǎng)環(huán)境。RT-PCR示低氧組和常氧組PANC-1細(xì)胞的MIC A的mRNA水平分別為0.514±0.104、0.540±0.125，MIC B的mRNA水平分別為0.663±0.189、0.697±0.176，兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P>0.05)。FACS示NO-cGMP-PKG信號(hào)通路激活劑會(huì)上調(diào)低氧組PANC-1細(xì)胞膜上的MIC的表達(dá)率

8、及NK細(xì)胞的NKG2D表達(dá)率；ELISA法顯示激活劑還能主要減少可溶性MICA的產(chǎn)生；MTT法則表明激活劑能增強(qiáng)PANC-1細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的敏感性。抑制劑則起相反作用。3.GTN對(duì)PANC-1細(xì)胞皮下成瘤有較明顯抑制作用，治療28天后安慰劑組和治療組的瘤體大小分別為1550.4±148.6 mm3和750.6±71.2mm3，平均抑制率達(dá)到51.59％。免疫組化顯示，治療組HIF-1α蛋白表達(dá)低于安慰劑組，MIC蛋白表達(dá)高于于安慰劑組(

9、P<0.05)。RT-PCR和Western Blot分別定量檢測(cè)瘤體中MIC基因和蛋白的水平。結(jié)果示MICA和MIC B基因在兩組瘤體中均表達(dá)，治療組瘤體中MIC A的mRNA的表達(dá)水平為0.748±0.112，MIC B的mRNA的表達(dá)水平為0.321±0.131。安慰劑組瘤體中MIC A的mRNA的表達(dá)水平為0.702±0.157，MIC B的mRNA的表達(dá)水平為0.298±0.173，兩組無(wú)顯著差異(P>0.05)。治療組瘤體中

10、MIC蛋白的表達(dá)水平為0.688±0.214，安慰劑組瘤體中MIC蛋白的表達(dá)水平為0.363±0.123，治療組顯著高于安慰劑組(P<0.01)。同時(shí)ELISA法示正常裸鼠的sMIC A和sMIC B水平分別為15.2±21.4pg/ml和0±10.2 pg/ml，治療組sMICA和sMICB水平分別為345.1±125.2pg/ml和52.8±25.2 pg/ml，安慰劑組裸鼠血清中的sMICA和sMICB水平分別為674.2±205

11、.4pg/ml和144.4±61.8pg/ml，治療組低于安慰劑組，高于正常裸鼠，有顯著差異(P<0.001)。FACS示正常組裸鼠血液中的NKG2D表達(dá)率為68.51±19.42％，治療組裸鼠血液中的NKG2D的表達(dá)率為60.52±10.52％，安慰劑組裸鼠血液中的NKG2D的表達(dá)率為39.88±10.14％，正常組高于治療組(P=0.002)，治療組和正常組的NKG2D的表達(dá)率均高于安慰劑組(P<0.001)。NKG2D的表達(dá)率與s

12、MIC的表達(dá)水平之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.905，P<0.001)。
　　 結(jié)論：胰腺癌組織中的HIF-1α表達(dá)率和表達(dá)水平顯著高于慢性胰腺炎和正常胰腺組織，反映胰腺癌組織中存在缺氧微環(huán)境，而HIF-1α和MIC在胰腺癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)提示低氧與腫瘤免疫逃逸有關(guān)。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，其機(jī)制在于胰腺癌細(xì)胞膜上大量MIC脫落形成sMIC，sMIC封閉NK細(xì)胞上的NKG2D受體，降低NK細(xì)胞的殺傷活性。NO-cGMP-PKG信號(hào)通路與低氧誘