低氧誘導(dǎo)胰腺癌免疫逃避機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路的初步研究.pdf_第1頁(yè)
已閱讀1頁(yè),還剩167頁(yè)未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、目的:胰腺癌是臨床上常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,手術(shù)為其最佳治療方法。然而,手術(shù)切除率低,對(duì)化療藥物普遍耐藥,復(fù)發(fā)率高導(dǎo)致胰腺癌預(yù)后極差,尋找新的治療方法成為目前研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)首先驗(yàn)證胰腺癌腫瘤內(nèi)的低氧微環(huán)境及其與MIC表達(dá)的相關(guān)性,接著在體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建低氧模型并研究低氧環(huán)境中胰腺癌細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制。同時(shí)我們?cè)诩?xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中和裸鼠成瘤模型中通過(guò)直接激活NO-cGMP-PKG信號(hào)通路來(lái)研究其對(duì)低氧誘導(dǎo)下胰腺癌細(xì)胞逃避自然殺傷作用的逆

2、轉(zhuǎn)效果,為臨床上應(yīng)用激活NO-cGMP-PKG信號(hào)通路的手段促進(jìn)先天性免疫系統(tǒng)抑制胰腺癌的發(fā)展提供理論上的依據(jù)和新的線索。
   方法:第一部分:收集湘雅醫(yī)院2002年1月至2008年5月手術(shù)切除的胰腺癌組織標(biāo)本42例,慢性胰腺炎組織標(biāo)本9例,8例正常胰腺組織來(lái)自移植中心提供或尸檢。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HIF-1α和MIC在胰腺癌標(biāo)本、慢性胰腺炎標(biāo)本和正常胰腺標(biāo)本中的表達(dá)情況,分析兩者之間的相關(guān)性。第二部分:構(gòu)建低氧培養(yǎng)模型,體外

3、常氧及低氧條件下培養(yǎng)胰腺癌PANC-1細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)法和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞膜上MIC的表達(dá),逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)檢測(cè)PANC-1細(xì)胞中MIC A和MIC B的mRNA表達(dá)變化。分選、純化、擴(kuò)增人外周血NK細(xì)胞,酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)不同氧濃度及NO-cGMP-PKG信號(hào)通路激活或抑制時(shí)對(duì)PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)基中可溶性MIC A和可溶性MIC B的表達(dá)影響,同時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)PANC-1細(xì)胞膜上的MIC表達(dá)和PANC-1培養(yǎng)基與自然

4、殺傷細(xì)胞共培養(yǎng)后NK細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)。MTT法檢測(cè)不同靶效比時(shí)NK細(xì)胞對(duì)不同氧濃度培養(yǎng)及NO-cGMP-PKG信號(hào)通路激活或抑制時(shí)PANC-1細(xì)胞的殺傷活性。第三部分:PANC-1細(xì)胞裸鼠皮下成瘤,隨機(jī)分成治療組與安慰劑組,硝酸甘油為治療藥物。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)兩組腫瘤標(biāo)本中HIF-1α和MIC的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)檢測(cè)兩組腫瘤標(biāo)本中中MIC A和MIC B mRNA表達(dá)變化。蛋白印記法檢測(cè)兩組腫瘤標(biāo)本中的MIC表達(dá)差異。酶

5、聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)兩組成瘤裸鼠及正常裸鼠血清中的可溶性MIC A及可溶性MIC B差異。流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組成瘤裸鼠及正常裸鼠血液中NK細(xì)胞上NKG2D的表達(dá)差異。
   結(jié)果:1.免疫組化示胰腺癌組織中HIF-1α蛋白和MIC蛋白陽(yáng)性率分別為為32/42(76.2%)、38/42(90.5%),明顯高于慢性胰腺炎組織2/9(22.2%)、2/9(22.2%)和正常胰腺組織0/8(0%)、1/8(12.5%)(P<0.001)。Ⅰ-

6、Ⅱ期標(biāo)本中,HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率為57.1%,低于Ⅲ-Ⅳ期標(biāo)本中的92.9%(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為91.3%,高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的57.9%(P<0.05)。在不同病理分級(jí)和臨床分期的標(biāo)本中,MIC蛋白的表達(dá)高低也有顯著差異(P<0.05)。MIC蛋白和HIF-1α蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.522,P<0.001)。2.經(jīng)MACS免疫磁珠分選后(CD3-CD56+)NK細(xì)胞含量由分選前的

7、13.8±2.6%提高到92.1±3.7%,IL-2擴(kuò)增后滿足實(shí)驗(yàn)要求。三氣培養(yǎng)箱成功構(gòu)建了低氧培養(yǎng)環(huán)境。RT-PCR示低氧組和常氧組PANC-1細(xì)胞的MIC A的mRNA水平分別為0.514±0.104、0.540±0.125,MIC B的mRNA水平分別為0.663±0.189、0.697±0.176,兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P>0.05)。FACS示NO-cGMP-PKG信號(hào)通路激活劑會(huì)上調(diào)低氧組PANC-1細(xì)胞膜上的MIC的表達(dá)率

8、及NK細(xì)胞的NKG2D表達(dá)率;ELISA法顯示激活劑還能主要減少可溶性MICA的產(chǎn)生;MTT法則表明激活劑能增強(qiáng)PANC-1細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的敏感性。抑制劑則起相反作用。3.GTN對(duì)PANC-1細(xì)胞皮下成瘤有較明顯抑制作用,治療28天后安慰劑組和治療組的瘤體大小分別為1550.4±148.6 mm3和750.6±71.2mm3,平均抑制率達(dá)到51.59%。免疫組化顯示,治療組HIF-1α蛋白表達(dá)低于安慰劑組,MIC蛋白表達(dá)高于于安慰劑組(

9、P<0.05)。RT-PCR和Western Blot分別定量檢測(cè)瘤體中MIC基因和蛋白的水平。結(jié)果示MICA和MIC B基因在兩組瘤體中均表達(dá),治療組瘤體中MIC A的mRNA的表達(dá)水平為0.748±0.112,MIC B的mRNA的表達(dá)水平為0.321±0.131。安慰劑組瘤體中MIC A的mRNA的表達(dá)水平為0.702±0.157,MIC B的mRNA的表達(dá)水平為0.298±0.173,兩組無(wú)顯著差異(P>0.05)。治療組瘤體中

10、MIC蛋白的表達(dá)水平為0.688±0.214,安慰劑組瘤體中MIC蛋白的表達(dá)水平為0.363±0.123,治療組顯著高于安慰劑組(P<0.01)。同時(shí)ELISA法示正常裸鼠的sMIC A和sMIC B水平分別為15.2±21.4pg/ml和0±10.2 pg/ml,治療組sMICA和sMICB水平分別為345.1±125.2pg/ml和52.8±25.2 pg/ml,安慰劑組裸鼠血清中的sMICA和sMICB水平分別為674.2±205

11、.4pg/ml和144.4±61.8pg/ml,治療組低于安慰劑組,高于正常裸鼠,有顯著差異(P<0.001)。FACS示正常組裸鼠血液中的NKG2D表達(dá)率為68.51±19.42%,治療組裸鼠血液中的NKG2D的表達(dá)率為60.52±10.52%,安慰劑組裸鼠血液中的NKG2D的表達(dá)率為39.88±10.14%,正常組高于治療組(P=0.002),治療組和正常組的NKG2D的表達(dá)率均高于安慰劑組(P<0.001)。NKG2D的表達(dá)率與s

12、MIC的表達(dá)水平之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.905,P<0.001)。
   結(jié)論:胰腺癌組織中的HIF-1α表達(dá)率和表達(dá)水平顯著高于慢性胰腺炎和正常胰腺組織,反映胰腺癌組織中存在缺氧微環(huán)境,而HIF-1α和MIC在胰腺癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)提示低氧與腫瘤免疫逃逸有關(guān)。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證明,其機(jī)制在于胰腺癌細(xì)胞膜上大量MIC脫落形成sMIC,sMIC封閉NK細(xì)胞上的NKG2D受體,降低NK細(xì)胞的殺傷活性。NO-cGMP-PKG信號(hào)通路與低氧誘

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論