USP49-FKBP5-AKT信號(hào)通路與胰腺癌耐藥性機(jī)制.pdf

1、目的:絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT（也被稱為PKB），是細(xì)胞生長的中心調(diào)控因子。AKT信號(hào)參與細(xì)胞體內(nèi)多種信號(hào)途徑，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，其活性異常不僅能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而且與腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附、血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等相關(guān)，它的超活化導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及化療耐受。之前的研究表明，磷酸化酶PHLPP能夠?qū)KT-Ser473位點(diǎn)去磷酸化負(fù)調(diào)控AKT的活性。FKBP5作為骨架蛋白，可促進(jìn)PHLPP-AKT蛋白相互作用，并參與

2、PHLPP介導(dǎo)的AKT-Ser473去磷酸化，F(xiàn)KBP5通過調(diào)控AKT信號(hào)通路中起到了抑制腫瘤發(fā)生的作用。但是，目前關(guān)于FKBP5的調(diào)控機(jī)制還不是很清楚。在本文中，我們主要尋找FKBP5的調(diào)控蛋白，研究其對FKBP5的調(diào)控機(jī)制以及該蛋白是如何通過FKBP5-AKT通路調(diào)控腫瘤的生長和對化療藥物的耐受性。
　　方法:(1)通過串聯(lián)親和純化及質(zhì)譜分析（TAP-MS）尋找FKBP5的互作蛋白。(2)利用病毒感染的方法建立FKBP5互作蛋

3、白的過表達(dá)或敲低細(xì)胞穩(wěn)定株，免疫印跡法檢測FKBP5的蛋白表達(dá)及穩(wěn)定性。(3)利用體內(nèi)和體外泛素化實(shí)驗(yàn)，檢測目標(biāo)蛋白對FKBP5的泛素化調(diào)控情況。(4)利用病毒感染的方法建立FKBP5及其互作蛋白的單敲低與雙敲低細(xì)胞穩(wěn)定株，免疫印跡法檢測AKT及其下游蛋白的磷酸化變化情況。(5)利用MTT實(shí)驗(yàn)、軟瓊脂實(shí)驗(yàn)檢測目標(biāo)蛋白對胰腺癌細(xì)胞生長的影響。(6)建立動(dòng)物模型，檢測目標(biāo)蛋白對腫瘤生長的影響。(7)利用免疫組化技術(shù)檢測FKBP5、P473-

4、AKT和目標(biāo)蛋白在組織芯片中的表達(dá)情況。(8)檢測目標(biāo)蛋白如何影響胰腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。
　　結(jié)果:(1)運(yùn)用串聯(lián)親和純化及質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)了FKBP5的互作蛋白去泛素化酶USP49，并利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了二者的相互作用。(2)敲低USP49能夠下調(diào)FKBP5的蛋白水平，F(xiàn)KBP5的蛋白穩(wěn)定性也隨之降低。(3)敲低USP49增加FKBP5的泛素化水平，過表達(dá)USP49則降低FKBP5的泛素化水平。(4)穩(wěn)定敲低USP49后

5、，AKT及下游蛋白的磷酸化水平增加。但是在敲低FKBP5的基礎(chǔ)上再敲低USP49，AKT及下游蛋白的磷酸化平便不再變化。(5)穩(wěn)定敲低USP49能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖;但是在敲低FKBP5的基礎(chǔ)上再敲低USP49，則不再進(jìn)一步促進(jìn);(6)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，穩(wěn)定敲低USP49能夠促進(jìn)小鼠腫瘤的生長;在敲低USP49基礎(chǔ)上再過表達(dá)FKBP5，腫瘤的生長能力又恢復(fù)正常。(7)免疫組化結(jié)果表明，USP49與FKBP5在胰腺癌組織中表達(dá)呈正相關(guān)，而

6、USP49和P473-AKT表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。(8) USP49能夠增加胰腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。
　　結(jié)論:本文發(fā)現(xiàn)去泛素化酶USP49，作為一個(gè)新的AKT信號(hào)通路調(diào)控因子，能夠去泛素化穩(wěn)定FKBP5，加強(qiáng)PHLPP介導(dǎo)的AKT的去磷酸化調(diào)節(jié)。此外，USP49能夠抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。臨床上，USP49在胰腺癌組織樣本中低表達(dá)，且與FKBP5表達(dá)呈正相關(guān)而與AKT-Ser473磷酸化的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)