HIF-1α介導(dǎo)EMT在缺氧誘導(dǎo)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 本課題通過檢測胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)和上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(epithelial to mesenchvmal transition，EMT)相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討這些蛋白與PDAC患者臨床病理及預(yù)后的關(guān)系；體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究缺氧微環(huán)境下HIF-1α對胰腺癌細(xì)胞侵

2、襲遷移和轉(zhuǎn)移的影響，并探索缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)EMT的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 (1)采用免疫組化檢測92例PDAC癌組織和10例正常胰腺組織中HIF-1α、Snail、Slug、E-cadherin、N-cadherin、整合素α3和α6的表達(dá)。
　　 (2)選用三株不同轉(zhuǎn)移潛能的人胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1、Capan-2和Panc-1，常氧、缺氧、缺氧狀態(tài)下阻斷HIF-1α的表達(dá)，應(yīng)用形態(tài)學(xué)觀察，Transw

3、ell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)檢測其體外侵襲遷移能力，qRT-PCR及Western-blot檢測HIF-1α及EMT相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 (3)采用生物信息學(xué)分析Snail啟動子區(qū)域HIF-1α潛在的結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶報告基因分析、EMSA和ChIP檢測Snail啟動子區(qū)域是否存在HIF-1α特異性結(jié)合的HRE。
　　 (4)動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證沉默HIF-1α基因表達(dá)對體內(nèi)移植瘤的生長情況和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響。
　　 結(jié)果：

4、r>　　 (1)HIF-1α、Snail、Slug、N-cadherin、整合素α3/α6在PDAC組織中高表達(dá)而E-cadherin低表達(dá)；HIF-1α的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，Snail的表達(dá)與TNM分期有關(guān)，Slug的表達(dá)與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，N-cadherin的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度有關(guān)，整合素α3的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，整合素α6的表達(dá)與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；HIF-1α的表達(dá)與Snail、

5、Slug的表達(dá)呈正相關(guān)，與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Snail的表達(dá)與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，E-cadherin的表達(dá)與N-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；HIF-1α、Snail和E-cadherin是PDAC患者術(shù)后獨(dú)立的預(yù)后因素。
　　 (2)缺氧誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1、Capan-2、Panc-1發(fā)生典型的EMT樣形態(tài)學(xué)改變和體外侵襲遷移能力增強(qiáng)，上調(diào)HIF-1α、Snail、N-cadhe

6、rinmRNA和蛋白的表達(dá)，下調(diào)E-cadherin mRNA和蛋白的表達(dá)；抑制HIF-1α的表達(dá)后，缺氧所誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞EMT樣分子標(biāo)記改變和體外侵襲遷移能力增強(qiáng)被逆轉(zhuǎn)。
　　 (3)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Snail啟動子區(qū)域存在2個可能的HRE序列，分別位于(-653，-649)和(-543，-538)，熒光素酶報告基因分析證實(shí)Snail啟動子區(qū)(-543，-538)位點(diǎn)是HIF-1α特異性結(jié)合位點(diǎn)，EMSA和ChIP進(jìn)一步確

7、證Snail啟動子區(qū)存在HRE，位于(-543，-538)。
　　 (4)沉默Panc-1細(xì)胞株HIF-1α基因的表達(dá)，裸鼠爪墊移植瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯低于Panc-1親本細(xì)胞和Panc-1-NC細(xì)胞，但不影響其體內(nèi)增殖能力。
　　 結(jié)論：
　　 (1)HIF-1α、Snail、Slug、E-cadherin、N-cadherin、整合素α3/α6在PDAC中存在異常表達(dá)，并與PDAC的生物學(xué)行為有關(guān)，特別是轉(zhuǎn)

8、移；HIF-1α、Snail和E-cadherin是PDAC患者術(shù)后獨(dú)立的預(yù)后因素。
　　 (2)缺氧增加胰腺癌細(xì)胞HIF-1α和Snail的表達(dá)，促進(jìn)鈣粘素轉(zhuǎn)換；阻斷HIF-1α的表達(dá)，Snail的表達(dá)下調(diào)，逆轉(zhuǎn)鈣粘素轉(zhuǎn)換。提示缺氧誘導(dǎo)EMT，增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞體外侵襲和遷移能力可能是通過HIF-1α調(diào)控Snail的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
　　 (3)首次鑒定Snail啟動子區(qū)域存在HIF-1α的結(jié)合位點(diǎn)，HIF-1α與之結(jié)合后直接調(diào)