ARHI基因誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞系PANC-1自噬作用及其相關(guān)機(jī)制初探.pdf

1、胰腺癌是死亡率最高的惡性腫瘤之一,目前臨床多種治療措施未能顯著延長(zhǎng)胰腺癌患者生存期。深入了解胰腺癌細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、程序性細(xì)胞死亡、遷移等異常生物學(xué)行為及其分子機(jī)制,是尋找更有效的腫瘤干預(yù)措施、提高胰腺癌治療效果的重要手段。
　　 近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)自噬現(xiàn)象與腫瘤關(guān)系密切,多種抑癌基因可誘導(dǎo)自噬。誘導(dǎo)或抑制自噬都可能成為有效的腫瘤治療措施,但需要根據(jù)腫瘤發(fā)展的不同階段、不同的腫瘤類型選擇誘導(dǎo)或抑制自噬。
　　 ARHI基因是1

2、999年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)母源性印跡基因,是Ras超家族成員之一,也是小分子G蛋白的一種,但GTP酶活性低。其編碼的蛋白在人類多種組織中表達(dá)。與大部分Ras家族成員是癌基因和促生長(zhǎng)調(diào)控因子不同,研究證實(shí)ARHI基因在卵巢癌和乳腺癌中是抑癌基因,可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移,過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。新近研究發(fā)現(xiàn),抑癌基因ARHI近似生理水平再表達(dá)可誘導(dǎo)多種人卵巢癌細(xì)胞系自噬性細(xì)胞死亡,而不是凋亡。
　　 我們實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明,ARHI基因

3、在胰腺癌組織中也發(fā)揮抑癌基因的作用。通過(guò)瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染將ARHI基因?qū)朐摶虮磉_(dá)缺失的胰腺癌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)ARHI抑制胰腺癌細(xì)胞系的增殖,誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞死亡,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ARHI可導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞周期停滯。
　　 ARHI是否誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞自噬目前尚未見(jiàn)報(bào)道,本課題在前期研究的基礎(chǔ)上探討ARHI基因瞬時(shí)表達(dá)是否誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞系PANC-1發(fā)生自噬,并初步探討其可能機(jī)制。
　　 一、抑癌基因ARHI對(duì)胰腺癌細(xì)胞系PANC-1自噬的

4、影響
　　 目的:探討ARHI基因再表達(dá)是否促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞系PANC-1自噬
　　 方法:應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的攜帶ARHI基因編碼序列的pIRES2-EGFP-ARHI質(zhì)粒,采用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞系PANC-1,用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率,用RT-PCR及western blot驗(yàn)證ARHI基因轉(zhuǎn)錄及翻譯水平表達(dá)情況；采用Hoechst33258染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài),PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用

5、吖啶橙染色觀察細(xì)胞內(nèi)嗜酸性自噬溶酶體,透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)具有雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。
　　 結(jié)果:1)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)ARHI組PANC-1細(xì)胞可見(jiàn)ARHI基因mRNA表達(dá),而空載體組及正常PANC-1細(xì)胞組無(wú)ARHI mRNA表達(dá)。ARHI組瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)可見(jiàn)ARHI蛋白表達(dá),空載體組無(wú)ARHI蛋白表達(dá)；2)轉(zhuǎn)染后120小時(shí)Hoechst33258染色ARHI組及空載體組均可見(jiàn)凋亡細(xì)胞核及凋亡小體,正常PANC-1細(xì)

6、胞未見(jiàn)明顯凋亡征象；3)轉(zhuǎn)染后120小時(shí)PI染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率,ARHI組細(xì)胞凋亡率(29.6±8.4)％,高于空載體組(23.4±6.8)％,但差異不具有顯著性(P>0.05)；4)轉(zhuǎn)染后72小時(shí)吖啶橙染色,可見(jiàn)ARHI組細(xì)胞內(nèi)亮紅色自噬溶酶體(9.3％)明顯高于空載體組(0.4％),差異具有顯著性(P<0.05)；通過(guò)透射電鏡證實(shí)了吖啶橙染色結(jié)果:ARHI基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞72小時(shí)透射電鏡可見(jiàn)典型自噬體,空載體轉(zhuǎn)染

7、組未見(jiàn)自噬體。
　　 小結(jié):1)ARHI基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率高于空載體轉(zhuǎn)染組,但差異無(wú)顯著性；2)ARHI再表達(dá)可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞系PANC-1發(fā)生自噬。
　　 二、抑癌基因ARHI誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞系PANC-1自噬的相關(guān)機(jī)制初探
　　 目的:探討ARHI再表達(dá)誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞系自噬的可能機(jī)制。
　　 方法:ARHI基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞48小時(shí)、72小時(shí)后分別提取細(xì)胞總蛋白,western b

8、lot檢測(cè)ARHI組及空載體組pERK、pAKT、AKT、DAPK1、ATG4B表達(dá)水平的差異。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)、72小時(shí)分別提取細(xì)胞胞漿蛋白,western blot檢測(cè)ARHI組及空載體組胞漿p53蛋白水平的差異。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后72小時(shí)進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色,觀察胞核p53蛋白水平的差異。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)提取細(xì)胞總RNA,Real time PCR檢測(cè)AKT下游信號(hào)分子TSC1、TSC2及自噬相關(guān)基因beclin1 mRNA水平表達(dá)改變。

9、
　　 結(jié)果:1)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)pERK與空載體組比較有輕度下調(diào),但無(wú)顯著性差異(P>0.05),72小時(shí)后ARHI組與空載體組pERK蛋白無(wú)明顯差異；2)與空載體組相比,ARHI組pAKT蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05),AKT蛋白無(wú)明顯變化；3)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)、72小時(shí)ARHI組與空載體組胞漿p53蛋白無(wú)明顯差異,酶免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示ARHI組與對(duì)照組胞核p53陽(yáng)性率分別為18％和8％(P<0.05)；4)與空載體組相

10、比,ARHI組DAPK1蛋白和ATG4B表達(dá)均增加(P<0.05)；5)與空載體相比,ARHI組TSC1、TSC2及beclin1 mRNA水平表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　 小結(jié):ARHI瞬時(shí)轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞系自噬可能與下調(diào)PI3K/AKT通路及上調(diào)胞核p53、抑癌基因DAPK1、自噬相關(guān)基因ATG4B有關(guān),與Ras/Raf/ERK通路無(wú)關(guān),與TSC1、TSC2及beclin1轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)無(wú)關(guān)。
　　 結(jié)論: