益肺活血顆粒對香煙提取物誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　慢性阻塞性肺疾病簡稱慢阻肺，是一種常見的、可以預(yù)防和治療的疾病。迄今對于慢阻肺的發(fā)病機(jī)制尚不明確，其中氧化-抗氧化失衡及異常氣道炎癥是慢阻肺的兩大關(guān)鍵環(huán)節(jié)。巨噬細(xì)胞是慢阻肺炎癥反應(yīng)中的主要效應(yīng)細(xì)胞，在慢阻肺炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。香煙煙霧被認(rèn)為是慢阻肺的主要發(fā)病因素，香煙煙霧可通過激活包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的炎性細(xì)胞引發(fā)氣道炎癥發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，此外，巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激、氧化-抗氧化失衡也參與了慢阻肺的發(fā)生發(fā)展。核轉(zhuǎn)錄因子

2、NF-κB是與炎癥密切相關(guān)的信號通路，NF-κB激活后可分泌大量炎癥介質(zhì)如IL-8和TNF-α等而加重慢阻肺炎癥反應(yīng)程度。益肺活血顆粒(YFHXG)是董建華院士研制的用于治療慢阻肺的經(jīng)驗(yàn)用藥，在臨床上應(yīng)用多年，療效顯著，但YFHXG治療慢阻肺的具體機(jī)制尚不明確。因此，本研究從氧化失衡及炎癥失控兩方面出發(fā)，擬用香煙提取物(CSE)刺激巨噬細(xì)胞體外模擬COPD氧化應(yīng)激及慢性炎癥環(huán)境，同時(shí)予以YFHXG干預(yù)，檢測各組巨噬細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS

3、)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性、IL-8、TNF-α表達(dá)及NF-κB活性變化，以期為進(jìn)一步闡明YFHXG治療慢阻肺的藥理機(jī)制提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　用佛波酯(PMA)將U937細(xì)胞誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞，并采用免疫熒光法對巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)志CD14進(jìn)行鑒定;用1.2～9.6g/L的YFHXG及0.5～10％的CSE處理巨噬細(xì)胞，于12、24、48h用CCK-8法測定細(xì)胞活性;將巨噬細(xì)胞分5組：正常細(xì)胞組、CSE組、

4、CSE+YFHXG低(1.2g/L)、中(2.4g/L)、高(4.8g/L)濃度組，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，WST-8法檢測細(xì)胞內(nèi)SOD活性，ELISA法檢測培養(yǎng)上清IL-8和TNF-α含量，RT-PCR法檢測胞內(nèi)IL-8和TNF-αmRNA水平;檢測YFHXG對NF-κB活性影響實(shí)驗(yàn)部分，共分4組：正常細(xì)胞組、CSE組、YFHXG(2.4g/L)+CSE組及小白菊內(nèi)酯(Parthenolide)+CSE組，Western-

5、blot法檢測胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p50/p65及p-IκB表達(dá)水平;免疫熒光法觀察胞核內(nèi)NF-κB p65及胞漿內(nèi)p-IκB表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.利用PMA成功地將U937細(xì)胞誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，獲得的巨噬細(xì)胞可表達(dá)特異性標(biāo)志CD14;
　　2.針對U937細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞，確立了合適的CSE濃度為5％，合適的YFHXG濃度區(qū)間為1.2～4.8g/L，合適的作用時(shí)間為24h;
　　3.CSE可誘

6、導(dǎo)U937細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞ROS生成增加，并減少胞內(nèi)SOD活性;YFHXG可逆轉(zhuǎn)CSE誘導(dǎo)的氧化損傷效應(yīng);
　　4.CSE可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放IL-8及TNF-α，YFHXG可以減輕CSE誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)，減少炎性介質(zhì)IL-8、TNF-α的表達(dá)，
　　5.CSE可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB活化，YFHXG可抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB活化。
　　結(jié)論：
　　香煙煙霧是導(dǎo)致慢阻肺的重要致病因素，可誘發(fā)慢阻肺巨噬細(xì)胞