香煙提取物對(duì)大鼠骨骼肌細(xì)胞MSTN及MHC表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　本研究從細(xì)胞模型水平，采用分子生物學(xué)和生理學(xué)的方法，研究MSTN參與COPD骨骼肌功能障礙的發(fā)病機(jī)制，以及骨骼肌纖維的轉(zhuǎn)換，為進(jìn)一步闡明COPD骨骼肌功能障礙的發(fā)病機(jī)制并對(duì)其進(jìn)行治療提供提供新的思路及策略。再者，證實(shí)香煙對(duì)骨骼肌的毒性作用，戒煙是防治COPD/肺氣腫的重要有效措施，具有重要的臨床和社會(huì)價(jià)值。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)股四頭肌細(xì)胞:選鼠齡3～5 d的SD大鼠拉頸處死，取大腿股四頭肌肌肉，去脂肪

2、、血液、結(jié)締組織，剪碎1mm3;在體外行骨骼肌原代細(xì)胞培養(yǎng)（分別行組織塊培養(yǎng)、單層細(xì)胞培養(yǎng)），倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征;細(xì)胞鑒定:取第3-5代細(xì)胞分化成熟后，行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察細(xì)胞形態(tài)特征，以及細(xì)胞免疫熒光鑒定;明確貼壁細(xì)胞為骨骼肌細(xì)胞。
　　1)實(shí)驗(yàn)分組:取第10代以內(nèi)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞覆蓋50％培養(yǎng)瓶時(shí)，分別加入含有0％、2.5％、5％、10％ CSE的胎牛血清培養(yǎng)基（香煙提取物統(tǒng)一為使用前30分鐘制備），放置培養(yǎng)

3、箱48小時(shí)后;隨機(jī)分四組:正常對(duì)照組、2.5％ CSE組、5.0％CSE組、10.0％CSE組。
　　2)基因水平檢測(cè):分別提取四組細(xì)胞的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MSTN mRNA、MHC-Ⅰ mRNA、MHC-Ⅱ A mRNA、MHC-ⅡB mRNA的表達(dá)。
　　3)蛋白水平檢測(cè):分別提取四組細(xì)胞的蛋白，煮沸變性，電泳、電轉(zhuǎn)，Westernblotting檢測(cè)MSTN蛋白的表達(dá)。
　　4)統(tǒng)計(jì)學(xué)

4、方法:計(jì)量資料以（(X)±s）表示，多組間比較采用單因素one-wayANOVA方差分析檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　(1)體外成功原代培養(yǎng)SD大鼠骨骼肌細(xì)胞:SD大鼠骨骼肌細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)，骨骼肌細(xì)胞剛鋪板于胎牛血清培養(yǎng)基時(shí)細(xì)胞呈圓形，形態(tài)均一，折光性強(qiáng)，懸浮于培養(yǎng)基中;5～6h后開(kāi)始貼壁，24 h后完全貼壁，并開(kāi)始增生，細(xì)胞逐漸延伸成梭形，相互融合，按一定方向有序排列。隨細(xì)胞密度的增

5、加，細(xì)胞逐漸有規(guī)律地平行排列;培養(yǎng)至2～3 d時(shí)細(xì)胞分化達(dá)到高峰，隨后逐漸開(kāi)始凋亡、漂浮。HE染色可見(jiàn)細(xì)胞核呈扁橢圓形，染成藍(lán)色，符合骨骼肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn);細(xì)胞免疫熒光檢查提示90％以上的細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)，細(xì)胞核染成藍(lán)色，符合骨骼肌細(xì)胞的表型特征。
　　(2)MSTN mRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:4組MSTN mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);其中，5.0％組、10.0％組MSTN mRNA相對(duì)表達(dá)

6、量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);伴隨CSE的濃度升高，目標(biāo)基因表達(dá)越高。支持當(dāng)初的實(shí)驗(yàn)設(shè)想，MSTN隨CSE的濃度升高，表達(dá)越高，(P＜0.05）。
　　(3)MHC-Ⅰ mRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:4組MHC-ⅠmRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);其中，5.0％組、10.0％組MHC-ⅠmRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);伴隨CSE的濃度升高，目標(biāo)基因表達(dá)

7、越低。支持當(dāng)初的實(shí)驗(yàn)設(shè)想，MHC-Ⅰ隨CSE的濃度升高，表達(dá)越低，（P＜0.05）。
　　(4)MHC-ⅡA mRNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:4組MHC-ⅡA mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，其中，2.5％組、5.0％組、10.0％組MHC-ⅡA mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，只有2.5％組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而5.0％組、10.0％組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　(5)MHC-Ⅱ BmRNA實(shí)時(shí)定量PC

8、R檢測(cè)結(jié)果顯示:經(jīng)3次更換MHC-ⅡB的引物，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，均未能作出擴(kuò)增曲線及溶解曲線。
　　(6)MSTN蛋白Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示:4組MSTN蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);其中，5.0％組、10.0％組MSTN蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組和2.5％組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;伴隨CSE的濃度升高，目標(biāo)蛋白表達(dá)越高。支持當(dāng)初的實(shí)驗(yàn)設(shè)想，MSTN隨CSE的濃度升高，表達(dá)越高，(P＜0