氧化應(yīng)激誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制及褪黑素抗氧化干預(yù)的研究.pdf

1、目的：
　　1．了解在H2O2氧化應(yīng)激的HaCaT細(xì)胞模型中，p38于細(xì)胞凋亡中的作用以及褪黑素抗氧化和抑制凋亡的效果。
　　2．探討大面積深Ⅱ度燙傷大鼠早期應(yīng)用褪黑素對(duì)燙傷皮膚殘留毛囊細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　3．研究大面積深Ⅱ度燙傷大鼠早期應(yīng)用褪黑素對(duì)機(jī)體的抗氧化和抗炎作用。
　　方法：
　　1．HaCaT細(xì)胞分成4組，對(duì)照組、氧化組、抑制劑組、褪黑素組。除對(duì)照組外，其余3組均給予終濃度為730μmol的H

2、2O2刺激12h。抑制劑組在刺激前用p38抑制劑SB203580與細(xì)胞共培養(yǎng)1h；褪黑素組在刺激前用褪黑素與細(xì)胞共培養(yǎng)12h。
　　2.（1）在刺激后12h，檢測(cè)細(xì)胞懸液MDA，GSH含量；（2）MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力；AO/EB(吖啶橙/溴化乙啶)和Hoechst33258熒光染色，caspase-3活性檢測(cè)，流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。（3）首先用Western blot檢測(cè)730μmol/L的H2O2刺激HaCaT細(xì)胞0（

3、加入H2O2后即刻）、5、20、30、60、90min時(shí)p38蛋白含量，篩選出p38蛋白表達(dá)最強(qiáng)的時(shí)間點(diǎn)；然后在此時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)各組細(xì)胞p38蛋白含量。
　　3．雄性SD大鼠48只，分為假燙組、燙傷組、褪黑素組，每組16只大鼠。燙傷組和褪黑素組大鼠在背部造成30％TBSA深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面，燙傷組和褪黑素組于傷后1h補(bǔ)充平衡液抗休克治療。并且褪黑素組于傷后1min、8h、16h，以10mg/kg的劑量給予腹腔注射褪黑素溶液。
　　4

4、．每組其中6只于6、12、24h采集燙傷區(qū)域皮膚檢測(cè)丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)；利用原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）和半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)燙傷皮膚組織殘留毛囊細(xì)胞凋亡情況。
　　5．每組其余10只大鼠于12h采集血清標(biāo)本檢測(cè)MDA、GSH等反應(yīng)自由基水平的指標(biāo)；用ELISA方法檢測(cè)TNF-α和IL-1β等炎癥因子指標(biāo)。于傷后12h采集燙傷皮膚組織，用TUNEL和cas

5、pase-3免疫組織化學(xué)檢測(cè)殘留毛囊細(xì)胞的凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　1.（1）在刺激12h后，氧化組的氧化損傷明顯強(qiáng)于對(duì)照組；而褪黑素組氧化損傷輕于氧化組，但高于對(duì)照組。（2）在刺激12h后，MTT法顯示對(duì)照組、氧化組、抑制劑組和褪黑素組細(xì)胞生存率分別為(99.12±2.34)％、(80.56±4.65)％、(90.02±5.15)％、(89.10±4.22)％；AO/EB和Hoechst33258熒光染色方法均顯示氧化組

6、的細(xì)胞凋亡率明顯高于抑制劑組和褪黑素組。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組、氧化組、抑制劑組和褪黑素組細(xì)胞凋亡比例分別為(4.20±1.25)％、(30.01±8.94)％、(15.56±3.80)％、(12.66±4.22)％。（3）730μmol/L的H2O2刺激細(xì)胞5min，p-p38表達(dá)開始增加，在30min后達(dá)高峰，90min時(shí)仍明顯高于對(duì)照組。選擇30min作為刺激時(shí)間點(diǎn)，利用Westernblot方法發(fā)現(xiàn)抑制劑組和褪黑素組的p-

7、p38水平明顯低于氧化組。
　　2．與假燙組比較，燙傷組各時(shí)間點(diǎn)的皮膚組織MDA顯著升高，傷后12h達(dá)2.83±0.43nmol/mgprot高峰；GSH水平明顯下降，傷后12h水平最低為0.95±0.21mg/gprot（P<0.01）。在所有時(shí)間點(diǎn)，燙傷組細(xì)胞凋亡率都高于假燙組（P<0.01）。TUNEL顯示燙傷組傷后6h殘留毛囊凋亡細(xì)胞率增加到（20.2±3.4）％，在12h細(xì)胞凋亡率最高達(dá)到（31.2±3.6）％。與燙傷組

8、比較，褪黑素組MDA水平低于燙傷組，GSH水平高于燙傷組（P<0.05）；褪黑素組的殘留毛囊細(xì)胞凋亡率低于燙傷組，褪黑素組在傷后6h、12h的細(xì)胞凋亡率分別（10.9±3.2）％、（19.1±3.7）％（P<0.05）。caspase-3免疫組織化學(xué)顯示了相似的凋亡趨勢(shì)。
　　3．與假燙組比較,燙傷組傷后12h血清MDA顯著升高，GSH明顯下降；TNF-α，IL-1β含量顯著增加（P<0.01）。與燙傷組比較，褪黑素組12h血清M

9、DA含量降低了34％；GSH增加了37％；TNF-α下降了29％；IL-1β降低了35％（P<0.05）。TUNEL顯示燙傷組傷后12h殘留毛囊凋亡細(xì)胞率為（30.9±2.5）％，高于假燙組的（3.8±1.9）％（P<0.01）。而褪黑素組毛囊凋亡細(xì)胞率降低為（20.2±2.4）％，低于燙傷組（P<0.05）。caspase-3免疫組織化學(xué)顯示了相似的凋亡趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　1．在H2O2氧化應(yīng)激HaCaT細(xì)胞模型中p3