TIP30感受細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)p53依賴(lài)的細(xì)胞凋亡機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:肝臟是人體的主要的解毒器官,代謝十分活躍,肝癌細(xì)胞的代謝不僅更為旺盛,而且代謝途徑和方式亦有著明顯變化。細(xì)胞代謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物,如活性氧分子簇(ROS)在細(xì)胞的許多死亡途徑中充當(dāng)?shù)诙攀沟淖饔?維持了正常細(xì)胞的衰老、死亡過(guò)程。腫瘤細(xì)胞能夠逃避這些死亡途徑,其抑癌基因的表達(dá)失調(diào)是重要原因之一。 TIP30,又稱(chēng)CC3或HTIP2,是一個(gè)抑癌基因的蛋白產(chǎn)物,能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡,在抑制肝癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。晶體結(jié)構(gòu)

2、的分析中TIP30的同源二聚體沿著中心對(duì)稱(chēng)軸出現(xiàn),接觸面存在一個(gè)由第172位的半胱氨酸形成的二硫鍵和一個(gè)PEG600分子。因?yàn)槎蜴I的變化對(duì)于細(xì)胞感受自身活性氧的水平的變化和信號(hào)傳遞起到關(guān)鍵作用,在氧化應(yīng)激的條件下TIP30可能被氧化形成分子間二硫鍵,執(zhí)行其抗腫瘤的功能。 基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的重要性逐漸的被人們所重視。處于信使RNA的3'非翻譯區(qū)的富含腺嘌呤脲嘧啶元件(ARE)有著調(diào)節(jié)信使RNA降解的功能。RNA結(jié)合蛋白HuR通

3、過(guò)和ARE反式結(jié)合,提高信使RNA穩(wěn)定性或者上調(diào)信使RNA穩(wěn)定性的翻譯水平,從而上調(diào)基因表達(dá)水平。HuR在細(xì)胞受到各種刺激時(shí)從細(xì)胞核向細(xì)胞漿中分布轉(zhuǎn)移,發(fā)揮對(duì)靶向結(jié)合的轉(zhuǎn)錄物提高穩(wěn)定性作用。細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體β2(Importin β2)參與了HuR向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。最近發(fā)現(xiàn)TIP30能夠和多種細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體β家族成員結(jié)合,抑制核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)并引起細(xì)胞凋亡。因此,TIP30可能通過(guò)與細(xì)胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)受體β結(jié)合的方式調(diào)控HuR在細(xì)胞內(nèi)的分布。

4、 先前發(fā)現(xiàn)TIP30能夠通過(guò)提高p53的表達(dá)水平而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而提高p53表達(dá)水平的方式并不是通過(guò)穩(wěn)定p53蛋白實(shí)現(xiàn)的。在本研究中發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激條件下TIP30能夠以形成二硫鍵的方式被氧化,導(dǎo)致HuR在細(xì)胞漿內(nèi)的積累和p53信使RNA的穩(wěn)定,最終誘導(dǎo)線(xiàn)粒體介導(dǎo)的凋亡。 研究方法: ①利用熒光染料2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(DCF-DA)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧強(qiáng)度。 ②Hoecest 33342染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

5、。四甲基諾丹明乙酯(TEME)染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡過(guò)程中線(xiàn)粒體膜電勢(shì)的去極化現(xiàn)象。 ③非還原性PAGE電泳和Western blotting蛋白印跡檢測(cè)蛋白分子分子構(gòu)象的變化。熒光共振能量傳遞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)活體細(xì)胞中蛋白二聚體的形成。 ④Real-time PCR檢測(cè)基因的信使RNA的表達(dá)水平。 ⑤細(xì)胞核與細(xì)胞漿的分離。 ⑥RNA干擾下調(diào)細(xì)胞內(nèi)基因信使RNA的表達(dá)。 ⑦通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)蛋白相互作用,蛋白

6、因子與信使RNA的結(jié)合。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: ①感染Ad-TIP30對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量高的肝癌HepG2細(xì)胞引起細(xì)胞死亡,細(xì)胞內(nèi)活性氧含量低的正常肝細(xì)胞則幾乎不受影響。 ②非還原膠電泳和熒光共振能量傳遞實(shí)驗(yàn)中顯示了氧化應(yīng)激條件下TIP30蛋白二聚體的形成。 ③外源性表達(dá)TIP30在氧化應(yīng)激條件下使得p53信使RNA表達(dá)水平上調(diào)并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。 ④外源性表達(dá)TIP30后引起細(xì)胞線(xiàn)粒體膜極性的降低和細(xì)胞凋亡

7、,p53缺失或者RNA干擾后表達(dá)下調(diào)的肝癌細(xì)胞系細(xì)胞中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。 ⑤在氧化應(yīng)激條件下外源性表達(dá)TIP30后p53信使RNA降解的半衰期顯著延長(zhǎng)。免疫共沉淀分析中,在外源性TIP30表達(dá)的情況下,信使RNA穩(wěn)定蛋白HuR與p53信使RNA的結(jié)合量。 ⑥TIP30在氧化應(yīng)激的條件下通過(guò)和核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Importinβ結(jié)合誘導(dǎo)HuR在細(xì)胞漿內(nèi)的積累。 研究結(jié)論:結(jié)果顯示TIP30通過(guò)提高p53信使RNA的穩(wěn)定性的方