線粒體應激與p53轉位誘導肝源細胞凋亡機制的研究.pdf

1、【背景】：
　　研究表明,酒精中毒性肝炎、病毒性肝炎、藥源性肝炎及肝癌等多種肝病都與氧化應激有關。肝損傷的重要表現之一是發(fā)生肝細胞凋亡,研究肝細胞凋亡既是防治肝損傷的需要,也對誘導腫瘤細胞凋亡具有借鑒意義。P53作為重要的應激傳感器,在ROS等不利因素的刺激作用下可誘導細胞發(fā)生凋亡。研究發(fā)現,細胞一旦出現氧化應激,p53就會大量表達,啟動細胞凋亡。但是,p53是通過哪些作用因素或途經誘導細胞凋亡的,目前尚不完全清楚。最近有研究發(fā)現

2、,在凋亡因子刺激下,p53可能轉位到線粒體發(fā)揮作用。而線粒體作為能量生產場所,也是自由基、活性氧(ROS)衍生的主要部位,同時又可能是ROS攻擊的主要靶點。然而,p53和線粒體以及細胞凋亡三者之間關系如何,至今仍然還是個“謎團”。
　　葡萄糖氧化酶(GlucoseOxidase,GOX),能高度專一性地催化β-D-葡萄糖與細胞內游離的氧反應,生成葡萄糖酸和過氧化氫(H2O2)。由于GOX的催化底物葡萄糖和氧氣在體內含量豐富,葡萄糖

3、氧化酶催化ROS生成體系既是細胞內存在的常見反應,也可以作為一個生理環(huán)境下H2O2釋放的理想模型。因此,采用GOX催化細胞內β-D-葡萄糖以產生內源性ROS,觀察p53和線粒體相關因子的變化,研究凋亡發(fā)生與調控過程,以期闡明p53參與誘導肝凋亡的可能機制,為肝損傷防治研究提供新的思路。
　　【目的】：
　　本項目通過葡糖糖氧化酶系統(tǒng)從體內和體外水平誘導肝細胞產生氧化應激,觀察細胞和線粒體中ROS水平變化;研究ROS是否能夠引

4、起線粒體膜通道孔開放與膜電位改變,以及誘導p53的線粒體轉位;探討p53、線粒體應激和肝源細胞凋亡的關聯性。具體研究目的如下:
　　1.觀察是否存在線粒體應激和p53線粒體轉位,并探討二者間的關聯性。
　　2.研究線粒體氧化應激過程中線粒體膜通透性和膜電位的變化。
　　3.探討線粒體應激條件下p53參與肝源細胞凋亡的調控過程。
　　【方法】：
　　以HepG2細胞(人肝癌細胞)和Babl/c小鼠為研究對象,

5、實驗分為:(A)正常對照組、(B)GOX處理組、(C)PFT+GOX組、(D)CsA+GOX組。研究肝細胞線粒體氧化應激,線粒體膜結構與功能破壞,p53表達和亞細胞定位及凋亡相關分子變化。同時采用p53抑制劑(Pifithrin-a,PFT)與線粒體膜通道孔抑制劑(CyclosporineA,CsA),進一步觀察p53對線粒體氧化應激、線粒體膜的功能及凋亡相關因子的抑制作用;深入研究線粒體應激與p53線粒體轉位參與調控細胞凋亡機制。

6、r>　　1.細胞水平實驗:采用HepG2細胞系作為實驗對象,利用葡萄糖+葡萄糖氧化酶ROS生成系統(tǒng)。采用免疫熒光和亞細胞蛋白免疫印跡法,研究ROS對肝細胞p53蛋白含量和亞細胞定位的影響。測定線粒體中超氧陰離子自由基清除劑MnSOD表達,并使用Mito-SOXTM為探針測定線粒體ROS的生成。測定線粒體膜電位,線粒體膜通透性改變,線粒體細胞色素c釋放,研究線粒體功能改變。提取線粒體、細胞質和細胞核,從整體和亞細胞水平分析細胞或組織中凋亡

7、相關蛋白,如細胞色素c、bax、caspase3、caspase9、p53蛋白水平變化,以及氧化還原蛋白MnSOD變化。探討氧化應激、p53水平、線粒體結構功能及肝源細胞凋亡之間的關系。
　　2.動物水平實驗:在完成細胞學研究的基礎上,采用Balb/C小鼠作為研究對象,通過小鼠尾靜脈射葡萄糖氧化酶,誘導小鼠肝臟的急性氧化損傷,并通過尾靜脈給予Pifithrin-α和CyclosporineA處理,生理鹽水作為對照。主要觀察指標如下

8、:處理完成后,取出小鼠肝組織,測定氧化還原、p53蛋白定位、膜損傷、細胞凋亡等指標的的變化,測定方法與細胞實驗一致。
　　【結果】：
　　(1)給予一定劑量葡萄糖氧化酶處理后,HepG2細胞活力明顯降低,細胞內ROS、MDA水平升高和GSH含量降低。MnSOD蛋白表達水平降低,Mito-SOXTM染色后線粒體超氧陰離子自由基水平顯著升高,線粒體出現了氧化應激狀態(tài)。
　　(2)GOX處理后HepG2細胞p53表達水平明顯

9、升高,p53大量向線粒體聚集,與以往文獻報道不同的是細胞核和細胞漿內p53水平無明顯變化。
　　(3)GOX處理后線粒體膜電位降低和膜通透性轉運孔開放,細胞色素c由線粒體釋放至細胞質中,Bax也由細胞漿向線粒體聚集,caspase-9、caspase-3激活。而AnnexinV/PI雙染和TUNEL陽性率增加,表明大量細胞凋亡。
　　(4)動物實驗表明,葡萄糖氧化酶導致小鼠肝細胞線粒體MDA和ROS水平升高,GSH水平降低。

10、尤其是p53水平上調并伴有線粒體轉位,抗氧化酶MnSOD表達與活性降低,肝細胞大量凋亡。
　　(5)給予p53抑制劑PFT(Pifithrin-α)和線粒體膜通道孔開放抑制劑CsA(CyclosporineA)處理均可以一定程度上抑制HepG2細胞和小鼠肝臟p53的轉位,修復或減輕線粒體應激損傷,細胞凋亡也明顯減輕。
　　【結論】：
　　(1)發(fā)現內源性ROS誘導肝細胞凋亡的調節(jié)因子p53蛋白,并不是像文獻報道的那樣在

11、細胞核發(fā)揮作用,而是通過轉位到線粒體發(fā)揮關鍵調控作用。
　　(2)發(fā)現線粒體膜通透性改變和即膜電位下降可能是引起p53出現線粒體轉位的重要途徑;而轉位到線粒體的p53通過調控MnSOD表達影響線粒體氧化應激。
　　(3)發(fā)現p53可能通過兩條途徑誘導細胞凋亡:一方面p53調控線粒體氧化應激,導致線粒體膜電位降低和膜通透性轉運孔開放,促進了細胞色素c由線粒體釋放至細胞質中,同時激活caspase-9、caspase-3;另一方