Cr（Ⅵ）在細(xì)胞p53封閉條件下的線粒體損傷效應(yīng).pdf

1、目的：在體外試驗(yàn)系統(tǒng)，研究Cr(Ⅵ)在p53封閉條件下對L-02肝細(xì)胞線粒體的損害效應(yīng)，為進(jìn)一步探討Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的獨(dú)立線粒體依賴性途徑奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：以L-02肝細(xì)胞為受試細(xì)胞，通過MTT試驗(yàn)分別檢測p53抑制劑(PFT-α)單獨(dú)及其與Cr(Ⅵ)共處理對L-02肝細(xì)胞存活率的影響，并檢測細(xì)胞核內(nèi)p53蛋白表達(dá)驗(yàn)證PFT-α對p53的抑制作用，篩選出有效的PFT-α及Cr(Ⅵ)作用濃度。其后續(xù)試驗(yàn)PFT-α濃度定為

2、20μmol/L，預(yù)處理4h，Cr(Ⅵ)濃度為20μmol/L，染毒時(shí)間為24h。將L-02肝細(xì)胞隨機(jī)分成對照細(xì)胞組(第1組)、Cr(Ⅵ)染毒組(第2組)、PFT-α預(yù)處理對照細(xì)胞組(第3組)、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒組(第4組)、PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒組(第5組)、PFT-α+NAC+Cr(Ⅵ)染毒組(第6組)?；瘜W(xué)比色法檢測細(xì)胞氧化損傷；熒光分光光度法檢測線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(PTP)、跨膜電位(Δψm)的變

3、化；western blotting檢測細(xì)胞色素C(Cyt C)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的蛋白含量；RT-PCR檢測Bcl-2及Bax的基因表達(dá)水平；DNA ladder檢測細(xì)胞凋亡。 結(jié)果： 1.20μmol/L PFT-α預(yù)處理細(xì)胞后可以明顯抑制細(xì)胞核內(nèi)p53蛋白表達(dá)水平。 2.染毒處理細(xì)胞氧化損傷：Cr(Ⅵ)、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒組與PFT-α十Z-VAD-fmk-Cr(Ⅵ)染毒組引起SOD、GST活

4、性明顯降低，GSH含量減少，MDA生成增多，與對照組比較差異有顯著性(P<0.05)；加入NAC后有明顯保護(hù)作用。 3.細(xì)胞線粒體膜損傷：與對照組相比Cr(Ⅵ)染毒組、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒組和PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒組細(xì)胞線粒體膜電位(△ψm)降低，PTP開放度增加，差異有顯著性(P<0.05)。加入NAC后有相應(yīng)的拮抗作用。 4.細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)控因子釋放：與對照組相比Cr(Ⅵ)染毒組、PFT

5、-α+Cr(Ⅵ)染毒組與PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒組細(xì)胞胞漿CytC和AIF蛋白增加，加入NAC后均出現(xiàn)明顯減少(P<0.05)。 5.Bcl-2及Bax基因表達(dá)水平改變：與對照組相比Cr(Ⅵ)染毒組、PFT-α+Cr(Ⅵ)染毒組與PFT-α+Z-VAD-fmk+Cr(Ⅵ)染毒組細(xì)胞Bcl-2和Bax基因表達(dá)減少，加入NAC后均出現(xiàn)相應(yīng)基因表達(dá)的增多。 6.細(xì)胞核DNA損傷：Cr(Ⅵ)、PFT-α+C

6、r(Ⅵ)與PFT-α+Z-VAD-fmk＋Cr(Ⅵ)染毒組細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡典型的DNA梯帶降解現(xiàn)象，加入NAC后未見明顯保護(hù)作用。 結(jié)論：p53封閉條件下，20μmol/L Cr(Ⅵ)能明顯引起L-02肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致線粒體膜損傷、cyt C與凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)釋放與細(xì)胞DNA損傷；同時(shí)在抑制caspase條件下，受試細(xì)胞仍然表現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。結(jié)果提示，Cr(Ⅵ)可能繞過p53/caspase環(huán)節(jié)直接通過損傷細(xì)胞線粒體而誘導(dǎo)凋