題目一：ZEB1誘導(dǎo)的miR-99b-let-7e-miR-125a基因簇促進(jìn)食管鱗癌侵襲和轉(zhuǎn)移題目二：USP39促進(jìn)食管鱗癌的生長(zhǎng)并且預(yù)測(cè)不良預(yù)后.pdf

1、本文從以下幾部分闡述了ZEB1誘導(dǎo)的miR--99b/let--7e/miR--125a基因簇促進(jìn)食管鱗癌侵襲和轉(zhuǎn)移；USP39促進(jìn)食管鱗癌的生長(zhǎng)并且預(yù)測(cè)不良預(yù)后
　　第一部分 ZEB1誘導(dǎo)的miR-99b/let-7 e/miR-125a基因簇促進(jìn)食管鱗癌侵襲和轉(zhuǎn)移
　　食管癌是世界范圍內(nèi)最常見的消化道腫瘤之一，食管鱗癌在已確診的食管癌中占據(jù)90％的比例，而其中大約70％的病例發(fā)生在中國(guó)。食管鱗癌是世界第六、中國(guó)第四致死性

2、的癌癥，其5年總生存率不超過25％，主要?dú)w咎于患者在確診時(shí)就已經(jīng)進(jìn)入晚期，往往伴隨著腫瘤局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。因此，提高食管鱗癌的早期診斷和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移成為當(dāng)前工作的重中之重。
　　microRNA(miRNA)是一類小分子非編碼RNA，能通過降解靶mRNA或者抑制翻譯的方式來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。近些年的研究顯示，miRNA通過各種不同途徑參與食管鱗癌的發(fā)生和進(jìn)展。在本研究中，應(yīng)用一個(gè)體外Transwe

3、ll模型，旨在從包含約1000個(gè)前體miRNA的慢病毒文庫中篩查出促進(jìn)食管鱗癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的miRNA。結(jié)果，一個(gè)由miR-99b/let-7 e/miR-125a三者組成的miRNA基因簇從候選者中脫穎而出。過表達(dá)miR-99b/let-7e/miR-125a基因簇在體外促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的侵襲和遷移，并且誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)性轉(zhuǎn)移;與此同時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期并無影響。在食管鱗癌組織標(biāo)本中，檢測(cè)到miR-99b/let-7e/miR-125

4、a的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)。應(yīng)用生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)到轉(zhuǎn)錄因子ZEB1能結(jié)合在miR-99b/let-7e/miR-125a基因簇的啟動(dòng)子區(qū)，并通過ChIP實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ZEB1在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)miR-99b/let-7e/miR-125a的表達(dá)，敲降ZEB1會(huì)引起miRNA成熟體和初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的降低。為了尋找miR-99b/let-7e/miR-125a基因簇在食管鱗癌中的潛在靶基因，結(jié)合基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)和公共預(yù)測(cè)軟件分析

5、，在隨后的研究中揭示出ARID3A是miR-99b/let-7 e/miR-125a基因簇的直接靶基因。在細(xì)胞系中敲降A(chǔ)RID3A能夠模擬過表達(dá)miR-99b/let-7e/miR-125a的細(xì)胞表型變化，而過表達(dá)ARID3A則抵消miR-99b/let-7e/miR-125a的促轉(zhuǎn)移功能。此外，ZEB1能夠下調(diào)ARID3A的表達(dá)，并且此調(diào)節(jié)是依賴于miR-99b/let-7e/miR-125a的。最后，還分析了GEO數(shù)據(jù)庫中的食管鱗癌

6、標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)ARID3A與ZEB1的表達(dá)成負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　綜上所述，miR-99b/let-7e/miR-125a基因簇在食管癌轉(zhuǎn)移過程中擔(dān)當(dāng)驅(qū)動(dòng)因子，ZEB1在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)mi-99b/let-7e/miR-125a的表達(dá)。作為其下游的直接靶基因，ARID3A在腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中起阻礙作用，并且被ZEB1以依賴于miRNA的方式下調(diào)。通過分析臨床數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)miR-99b/let-7e/miR-125a的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)。我們

7、的研究闡明了mi-99b/let-7e/mi-125a基因簇在食管鱗癌轉(zhuǎn)移中的重要作用。
　　第二部分 USP39促進(jìn)食管鱗癌的生長(zhǎng)并且預(yù)測(cè)不良預(yù)后
　　泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是真核細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，參與細(xì)胞內(nèi)80％以上蛋白質(zhì)的降解。該系統(tǒng)存在一個(gè)可逆的環(huán)節(jié)，去泛素化酶(DUB)就在這個(gè)環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用。目前研究證實(shí)，存在6種不同類型的DUB，均能對(duì)底物蛋白上標(biāo)記的泛素分子鏈進(jìn)行水解，從而阻止蛋白被降解。而某些D

8、UB的表達(dá)失調(diào)、功能異常直接關(guān)乎代謝紊亂、精神疾病或者腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　為了鑒定與腫瘤發(fā)展相關(guān)的DUB，應(yīng)用一個(gè)靶向98個(gè)已知人源DUB的siRNA文庫展開系統(tǒng)的篩查。先向目標(biāo)細(xì)胞轉(zhuǎn)染每一個(gè)DUB siRNA，48小時(shí)后通過SRB染色、計(jì)數(shù)的方法，判別各處理組對(duì)細(xì)胞存活的影響。在對(duì)前期篩選結(jié)果進(jìn)行簡(jiǎn)單的預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)USP39的效果比較顯著，然后決定開展USP39在食管癌中功能機(jī)制的進(jìn)一步研究。
　　首先，證明USP

9、39對(duì)細(xì)胞增殖有明顯的促進(jìn)作用。穩(wěn)定敲降USP39的KYSE450細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的細(xì)胞增殖抑制、單細(xì)胞克隆形成減少和裸鼠移植瘤生長(zhǎng)緩慢的特征。而在USP39穩(wěn)定過表達(dá)的食管癌細(xì)胞中，則表現(xiàn)出相反的效果，具體體現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增殖、增強(qiáng)克隆形成能力和加快裸鼠移植瘤生長(zhǎng)。
　　緊接著，在對(duì)細(xì)胞凋亡的研究中，發(fā)現(xiàn)敲降USP39雖不能直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但卻能大幅度增強(qiáng)順鉑對(duì)食管癌細(xì)胞的殺傷力。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究顯示，敲降USP39促進(jìn)PAR

10、P蛋白的切割，從而加速細(xì)胞的不穩(wěn)定，為走向細(xì)胞凋亡埋下伏筆。敲降USP39還會(huì)促進(jìn)Bak、抑制Bcl-2蛋白水平的表達(dá)，這些都是與細(xì)胞凋亡過程密切相關(guān)的明星分子。而在KYSE30細(xì)胞中，過表達(dá)USP39能夠幫助細(xì)胞抵御化療藥物順鉑的損傷，具體表現(xiàn)為抑制PARP和Caspase3的活性切割。因此，認(rèn)為敲降USP39具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，可能幫助食管癌患者增加對(duì)順鉑（乃至其它化療藥）治療的敏感性。
　　另外，通過體外Transwel

11、l實(shí)驗(yàn)證實(shí)了USP39促進(jìn)細(xì)胞遷移的能力，敲降USP39則表現(xiàn)出抑制遷移的效果。并且USP39對(duì)細(xì)胞遷移的影響是不依賴于細(xì)胞增殖或細(xì)胞凋亡的。
　　此外，為了研究USP39發(fā)揮功能的機(jī)制，采用免疫沉淀—質(zhì)譜(IP-MS)的方法，鑒定出一系列在食管癌細(xì)胞內(nèi)與USP39發(fā)生相互作用的蛋白。其中，大部分都是組成剪接體復(fù)合物或者核糖體復(fù)合物的小核糖核蛋白，例如，比較知名的有EFTUD2，PRPF3，PRPF31，PRP6等。而對(duì)IP-MS

12、的結(jié)果進(jìn)行GO分析，目標(biāo)富集頻率最高的生物學(xué)進(jìn)程是“剪接體介導(dǎo)的mRNA剪接”(36.2％)，隨后依次是“RNA剪接”(27.7％)和“mRNA加工”(25.5％)。在應(yīng)用KEGG分析后，只得到兩條信號(hào)通路，分別是剪接體信號(hào)通路和核糖體信號(hào)通路。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)USP39直接關(guān)乎剪接體或者核糖體的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響pre-mRNA的成熟、蛋白質(zhì)的翻譯，最終調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。然而，還需要更多的研究數(shù)據(jù)來證明這一假設(shè)。
　　最

13、后，為了研究USP39在臨床上的重要意義，通過免疫組化的方法檢測(cè)了199例食管癌組織芯片中USP39的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，USP39高表達(dá)的食管癌患者往往預(yù)后較差，其5年總生存率在25％左右;相比之下，USP39低表達(dá)的食管癌患者總生存期和無疾病生存期均比較高，其5年總生存率超過50％。
　　綜上所述，本研究結(jié)果表明USP39對(duì)食管癌增殖起到促進(jìn)作用，敲降USP39能夠抑制細(xì)胞體外增殖、減少克隆形成、減緩裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，還能夠增強(qiáng)